Complejo de péptido antigénico-proteína de choque térmico modificada.

Una dosis inyectable de una vacuna, comprendiendo la dosis células recombinantes no proliferativas modificadaspor ingeniería genética para secretar complejos de una proteína de choque térmico gp96 modificada y un antígenoen una cantidad suficiente para provocar la activación de una respuesta de linfocitos T CD8,

independientes de CD4,frente al antígeno cuando se administra a un sujeto, en la que la proteína de choque térmico modificada carece deuna secuencia de retención en el retículo endoplásmico

Complejo de péptido antigénico-proteína de choque térmico modificada Este invento fue realizado con ayuda gubernamental bajo la subvención número CA57904 concedida por “National Institutes of Health”. El gobierno tiene ciertos derechos en el invento.

1. Introducción El presente invento se refiere a métodos para preparar un material inmunogénico que es útil como una vacuna para la prevención y/o el tratamiento del cáncer o de enfermedades infecciosas. La vacuna está compuesta de complejos no covalentes de proteínas de choque térmico (hsps; del inglés, heat shock proteins) modificadas, incluyendo, pero sin limitarse a, hsp70, hsp90, gp96 y proteína disulfuro isomerasa, y péptidos antigénicos. La vacuna es capaz de provocar o aumentar la respuesta inmune de un sujeto contra tipos particulares de cáncer o contra células infectadas.

2. Antecedentes del invento

2.1. Patobiología del cáncer

El cáncer se caracteriza esencialmente por un aumento del número de células anormales procedentes de un tejido normal dado. El proceso morboso también implica la invasión de tejidos adyacentes por estas células anormales y la propagación de estas células anormales a ganglios linfáticos regionales y a sitios distantes (metástasis) a través del sistema circulatorio. Datos clínicos y estudios de biología molecular indican que el cáncer es un proceso de múltiples fases que comienza con cambios preneoplásicos menores que, bajo ciertas condiciones, pueden progresar hasta la neoplasia.

El crecimiento de células anormales premalignas viene ejemplificado por hiperplasia, metaplasia o, muy particularmente, displasia (para una revisión de dichos estados de crecimiento anormal, véase Basic Pathology de Robbins y Angell, 1976, 2ª edición, W. B. Saunders Co., Philadelphia, EE.UU., páginas 68-79) . La hiperplasia es una forma de proliferación celular controlada que acarrea un aumento del número de células en un tejido o un órgano, sin alteración significativa de la estructura o la función. Sólo como ejemplo, la hiperplasia endometrial precede a menudo al cáncer endometrial. La metaplasia es una forma de crecimiento celular controlado en que un tipo de célula adulta o totalmente diferenciada es sustituido por otro tipo de célula adulta. La metaplasia puede tener lugar

en células de tejido epitelial o conjuntivo. La metaplasia atípica afecta a un epitelio metaplásico algo desordenado. La displasia es frecuentemente un proceso precursor del cáncer y se encuentra principalmente en los epitelios; es la forma más desordenada de crecimiento celular no neoplásico, ocasionando una pérdida en la uniformidad de las células individuales y en la orientación arquitectónica de las células. Las células displásicas tienen a menudo núcleos anormalmente grandes y muy teñidos, y presentan pleomorfismo. La displasia se presenta característicamente donde existe irritación o inflamación crónicas, y se encuentra a menudo en el cuello uterino, las vías respiratorias, la cavidad oral y la vesícula biliar. La lesión neoplásica puede evolucionar clonalmente y desarrollar una capacidad creciente de invasión, crecimiento, metástasis y heterogeneidad, especialmente bajo condiciones en que las células neoplásicas escapan a la vigilancia inmune del huésped (I. Roitt, J. Brostoff y D. Male, 1993, Immunology, 3ª edición, Mosby, Saint Louis, EE.UU., páginas 17.1-17.12) .

2.2. Vacunación La vacunación ha permitido erradicar ciertas enfermedades, tales como poliomielitis, tétanos, varicela, sarampión, etc., en muchos países del mundo. Este planteamiento ha explotado la capacidad del sistema inmune para prevenir enfermedades infecciosas. Dicha vacunación con materias no vivas, tales como proteínas, conduce generalmente a una respuesta de anticuerpos o una respuesta de células T cooperadoras CD4+ (Raychaudhuri y Morrow, 1993, Immunology Today, 14: 344-348) . Por otra parte, la vacunación o infección con materias vivas, tales como células vivas o virus infecciosos, conduce generalmente a una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL; del inglés, cytotoxic T-lymphocyte) CD8+. Una respuesta de CTL es crucial para la protección frente a cánceres, virus 55 infecciosos y bacterias. Esto plantea un problema práctico, ya que la única forma de alcanzar una respuesta de CTL es usar agentes vivos que son de por sí patógenos. El problema es generalmente solventado usando cepas víricas y bacterianas atenuadas o matando células enteras que pueden ser usadas para vacunación. Estas estrategias han funcionado bien, pero el uso de cepas atenuadas siempre acarrea el riesgo de que el agente atenuado pueda recombinarse genéticamente con DNA del huésped y volverse una cepa virulenta. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos que puedan conducir a una respuesta de CTL CD8+ mediante la vacunación con materias no vivas, tales como proteínas, de un modo específico.

La era de la inmunología tumoral comenzó con los experimentos de Prehn y Main, quienes mostraron que antígenos de los sarcomas inducidos con metilcolantreno (MCA) eran tumoralmente específicos ya que mediante los ensayos 65 para trasplante no se podían detectar estos antígenos en el tejido normal de los ratones (Prehn et al., 1957, J. Natl. Cancer Inst. 18: 769-778) . Esta idea fue confirmada mediante otros experimentos con los que se demostró que, en el ratón en que se ha originado el tumor, se puede provocar una resistencia tumoralmente específica frente a tumores inducidos con MCA (Klein et al., 1960, Cancer Res. 20: 1561-1572) .

En estudios posteriores, también se hallaron antígenos tumoralmente específicos en tumores inducidos con otros carcinógenos químicos o físicos y en tumores espontáneos (Kripke, 1974, J. Natl. Cancer Inst. 53: 1333-1336; Vaage, 1968, Cancer Res. 28: 2477-2483; Carswell et al., 1970, J. Natl. Cancer Inst. 44: 1281-1288) . Puesto que en estos estudios se utilizó la inmunidad protectora frente al crecimiento de tumores trasplantados como criterio para los antígenos tumoralmente específicos, a estos antígenos se hace también comúnmente referencia como “antígenos de trasplante tumoralmente específicos” o “antígenos de rechazo tumoralmente específicos”. Diversos factores pueden influir en gran medida en la inmunogenicidad del tumor, incluyendo, por ejemplo, el tipo específico del carcinógeno implicado, la inmunocompetencia de huésped y el periodo de latencia (Old et al., 1962, Ann. N.Y. Acad. Sci. 101: 80-106; Bartlett, 1972, J. Natl. Cancer Inst. 49: 493-504) .

La mayoría de los carcinógenos, si no todos, son mutágenos que pueden causar mutación, lo que conduce a la expresión de antígenos tumoralmente específicos (Ames, 1979, Science 204: 587-593; Weisburger et al., 1981, Science 214: 401-407) . Algunos carcinógenos son inmunosupresores (Malmgren et al., 1952, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 79: 484-488) . Cierta evidencia experimental sugiere que hay una correlación inversa constante entre la inmunogenicidad de un tumor y el periodo de latencia (tiempo transcurrido entre la exposición al carcinógeno y la aparición del tumor) (Old et al., 1962, Ann. N.Y. Acad. Sci. 101: 80-106; y Bartlett, 1972, J. Natl. Cancer Inst. 49: 493-504) . Otros estudios han revelado la existencia de antígenos tumoralmente específicos que no conducen a rechazo pero que, no obstante, pueden estimular potencialmente respuestas inmunes específicas (I. Roitt, J. Brostoff y D. Male, 1993, Immunology, 3ª edición, Mosby, Saint Louis, EE.UU., páginas 17.1-17.12) .

2.3. Proteínas de choque térmico A las proteínas de choque térmico (hsps) se hace indistintamente referencia como “proteínas de estrés”. Las primeras proteínas de estrés que se identificaron eran proteínas sintetizadas por una célula en respuesta a un choque térmico. Hasta la fecha, se han identificado tres familias principales de hsp basándose en su peso molecular. Las familias han sido llamadas hsp60, hsp70 y hsp90, en las que los números reflejan el peso molecular aproximado de las proteínas de estrés en kilodáltones. Posteriormente, se halló que muchos miembros de estas familias son inducidos en respuesta a otros estímulos estresantes, incluyendo privación de nutrientes, alteración metabólica, radicales del oxígeno, e infección por patógenos intracelulares (véanse Welch, mayo de 1993, Scientific American 56-64; Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8: 401-420; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gething et al., 1992, Nature 355: 33-45; y Lindquist et al., 1988, Annu. Rev. Genetics 22: 631-677) .

Las principales hsps pueden acumularse con niveles muy elevados en células estresadas, pero se encuentran en niveles de bajos a moderados en células que no han resultado estresadas.... [Seguir leyendo]

1. Una dosis inyectable de una vacuna, comprendiendo la dosis células recombinantes no proliferativas modificadas por ingeniería genética para secretar complejos de una proteína de choque térmico gp96 modificada y un antígeno en una cantidad suficiente para provocar la activación de una respuesta de linfocitos T CD8, independientes de CD4, frente al antígeno cuando se administra a un sujeto, en la que la proteína de choque térmico modificada carece de una secuencia de retención en el retículo endoplásmico.

2. La dosis de la reivindicación 1, en la que las células recombinantes son células humanas. 10

3. La dosis de la reivindicación 1, en la que las células recombinantes son células cancerosas.

4. La dosis de la reivindicación 3, en la que las células cancerosas son células de cáncer de pulmón.

5. La dosis de la reivindicación 3, en la que las células recombinantes comprenden al menos dos tipos diferentes de células cancerosas originándose cada uno de los tipos diferentes de células cancerosas de diferentes donantes.

6. La dosis de la reivindicación 1, en la que las células recombinantes se han irradiado.

7. La dosis de la reivindicación 1, en la que la dosis de células secreta al menos 100 ng de los complejos en 24 horas de cultivo in vitro.

8. La dosis de la reivindicación 1, en la que el antígeno es un antígeno asociado a tumor expresado por las células.

9. La dosis de la reivindicación 1, en la que el antígeno es un antígeno viral o bacteriano.

10. La dosis de la reivindicación 1, en la que el antígeno es un antígeno de HIV.

11. La dosis de la reivindicación 1, en la que las células recombinantes comprenden un vector que codifica para el 30 antígeno.

12. La dosis de la reivindicación 1, en la que las células recombinantes se congelan y se contienen en una pluralidad de alícuotas.

13. Un medicamento que comprende la dosis de células recombinantes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, como ingrediente activo.

14. Uso de una composición que comprende la dosis de células recombinantes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa o 40 cáncer.

15. Un método que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un cultivo de células recombinantes modificadas por ingeniería genética para secretar complejos de 45 una proteína de choque térmico gp96 modificada y un antígeno, en el que la proteína de choque térmico carece de una secuencia de retención en el retículo endoplásmico;

(b) determinar la tasa de secreción de complejo por las células recombinantes cultivadas; 50 (c) preparar una dosis de las células recombinantes basándose en la tasa determinada en la etapa (b) ;

(d) irradiar la dosis de las células recombinantes para eliminar su proliferación mientras se mantiene su capacidad para secretar los complejos de proteína de choque térmico modificada-antígeno; y

(e) congelar las células recombinantes irradiadas en una pluralidad de alícuotas.