Colorantes de metino tio sustituidos.

Compuesto con la fórmula:**Fórmula**

en la que

el residuo representa un anillo aromático monocíclico o policíclico fusionado opcionalmente sustituido o un anillo heteroaromático que contiene nitrógeno monocíclico o policíclico fusionado opcionalmente sustituido;

X es oxígeno, azufre, selenio, telurio o un residuo seleccionado entre C(CH3)2 y NR1, en el que R1 es hidrógeno o alquilo C1-6;

R2 se selecciona del grupo que comprende alquilo C1-6, cicloalquilo C3-8, arilo, arilo(alquilo C1-3), hidroxialquilo,

alcoxialquilo, aminoalquilo, mono y dialquilaminoalquilo, trialquilamonioalquilo, alquilenocarboxilato,

alquilenocarboxamida, alquilenosulfonato, residuos que contienen un heteroátomo cíclico opcionalmente sustituido, o residuos que contienen un heteroátomo acíclico opcionalmente sustituido;

t ≥ 0 ó 1;

Z es la carga seleccionada entre 0 y 1;

R3, R9 y R10 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-6 y arilcarbonilo;

n ≥ 0, 1 ó 2; y

Q es un heterociclo del grupo de estructuras que comprende:**Fórmula**

en el que R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que comprende hidrógeno, halógeno, alquilo, cicloalquilo, heteroalquilo, heterocicloalquilo, alquenilo, polialquenilo, alquinilo, polialquinilo, alquenilalquinilo, alquilnitriltio, arilo, heteroarilo, alcoxi, alquiltio, ariltio, arilcarboniltio, dialquilamino, cicloheteroalquilcarboniltio, dialquilaminoalquilcarboniltio, trialquilamonioalquilcarboniltio, cicloalquiltio, cicloheteroalquiltio, trialquilamonioalquiltio, y nucleosidiltio, cada uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente; un residuo que contiene un heteroátomo acíclico, o un residuo que contiene un heteroátomo cíclico, una unión PUENTE-COLORANTE con la fórmula siguiente:**Fórmula**

en el que el PUENTE es un enlace covalente simple, o un enlace covalente lineal o ramificado, cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, que comprende 1-16 átomos diferentes al hidrógeno, tales como carbono, nitrógeno, fosfato, oxigeno, y azufre, de tal forma que la unión contiene cualquier combinación de enlaces alquilo, éter, tioéter, amina, éster, o amida; enlaces carbono-carbono simples, dobles, triples o aromáticos; enlaces fósforo-oxígeno, fósforoazufre, nitrógeno-nitrógeno o nitrógeno-oxígeno; o enlaces aromáticos o heteroaromáticos;

y un grupo reactivo seleccionado entre halógenos, hidroxi, alcóxidos, aminas, ácidos carboxílicos, haluros, alcoholes, aldehídos, tioles, alquilo, y ariltioles, alquil y arilsulfonilos, ésteres succinimidilos, cetonas e isotiocianatos;

cada uno de los cuales comprende opcionalmente un residuo de amonio cuaternario, y

R4 se selecciona del grupo que comprende arilcarboniltio, cicloheteroalquilcarboniltio, dialquilaminoalquilcarboniltio; trialquilamonioalquilcarboniltio, cicloalquiltio, cicloheteroalquiltio, trialquilamonioalquiltio, alquilnitriltio, y nucleosidiltio, cada uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente.

Colorantes de metino tio sustituidos SECTOR DE LA INVENCIÓN

La presente invención da a conocer a colorantes de unión a ácidos nucleicos de doble cadena.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los métodos para analizar variaciones en las secuencias de ADN se pueden dividir en dos categorías generales: 1) genotipado de variantes de secuencia conocidas y 2) cribado de variantes desconocidas. Existen diversos métodos para genotipar variantes se secuencia conocidas, métodos de una sola etapa, homogéneos, en tubo cerrado que utilizan sondas fluorescentes (Lay MJ, y otros, Clin. Chem. 1997; 43:2262-7) . En cambio, la mayoría de técnicas de cribado de las variantes desconocidas precisan de electroforesis de gel o de separación en columna tras la PCR. Dichas técnicas incluyen polimorfismos de conformación de una única cadena (Orita O, y otros, Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:2766-70) , migración de heterodúplex (Nataraj AJ, y otros, Electrophoresis 1999; 20:1177-85) , electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (Abrams ES, y otros, Genomics 1990; 7:463-75) , electroforesis en gel con gradiente de temperatura (Wartell RM y otros, J Chromatogr A 1998; 806:169-85) , métodos de división enzimática o química (Taylor GR, y otros, Genet Anal 1999; 14:181-6) , así como la secuenciación de ADN. La identificación de nuevas mutaciones mediante secuenciación también requiere varios pasos tras realizar la PCR, concretamente la secuenciación del ciclo y electroforesis en gel. La cromatografía líquida de alto rendimiento en condiciones desnaturalizantes (Xiao W, y otros, Hum Mutat 2001; 17:439-74) incluye la inyección del producto de la PCR en una columna.

Recientemente, se han utilizado métodos homogéneos de fluorescencia en estudios de mutaciones. El SYBR® Green I (Molecular Probes, Eugene, Oregon) es un colorante específico para ADN de doble cadena que se utiliza a menudo para hacer un seguimiento de la formación de producto (Wittwer CT, y otros, BioTechniques 1997; 22:130-8) y la temperatura de fusión (Ririe KM, y otros, Anal. Biochem 1997; 245:154-60) con PCR en tiempo real. Se ha podido detectar la presencia de cambios heterocigóticos de una sola base en productos de hasta 167 pb mediante análisis de la curva de fusión con SYBR® Green I (Lipsky RH, y otros, Clin Chem 2001; 47:635-44) . Sin embargo, posteriormente a la amplificación y previamente al análisis de fusión, se purificó el producto de la PCR y se añadieron elevadas concentraciones de SYBR® Green I. La concentración de SYBR® Green I que se utiliza para la detección en este método inhibe la PCR (Wittwer CT y otros, BioTechniques 1977; 22:130-1) ; por ese motivo, el colorante se añadió tras la amplificación. Sería adecuado un colorante que se pudiera utilizar para detectar la presencia de variaciones genéticas, incluidos los cambios heterocigóticos de una sola base y que a su vez se pudiera añadir previamente a la PCR.

Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son ampliamente la variación genética más observada en el ser humano y otras especies. En dichos polimorfismos, entre dos individuos solo varía una única base. Esta modificación puede llevar al cambio de un aminoácido en una proteína, alterar las tasas de transcripción, afectar el empalme del ARNm, o no tener ningún efecto aparente en los procesos celulares. En ocasiones, cuando este cambio es silencioso (por ejemplo, cuando el aminoácido por el que codifica no cambia) , el genotipado de los SNP puede seguir siendo valioso si la modificación está relacionada (asociada) con un único fenotipo provocado por otra alteración genética.

Existen varios métodos para el genotipado de SNP. La mayoría de ellos utilizan la PCR u otras técnicas de amplificación para amplificar el molde que se está estudiando. Se pueden utilizar técnicas contemporáneas o posteriores, incluyendo la electroforesis en gel, la espectrometría de masas y la fluorescencia. Las técnicas de fluorescencia resultan adecuadas ya que son homogéneas y no precisan de la adición de reactivos tras el inicio de la amplificación o muestreo físico de las reacciones para realizar el análisis. Algunos ejemplos de técnicas homogéneas utilizan cebadores de nucleótidos para localizar la región que se estudia, y etiquetas fluorescentes o colorantes para generar señales. Métodos ilustrativos de PCR son tubos completamente cerrados, utilizan una enzima termoestable que es estable a la temperatura de desnaturalización del ADN, de manera que no hace falta añadir más compuestos tras empezar el aumento de temperatura.

Se pueden utilizar varios métodos de PCR en tubo cerrado, homogéneos y fluorescentes para el genotipado de los SNP. Dichos métodos incluyen sistemas que utilizan sondas de nucleótidos FRET con dos cromóforos que interactúan (sondas de hibridación adyacente, sondas Taq Man, Molecular Beacons, Scorpions) , sondas de un único nucleótido con un solo fluoróforo (sondas G-quenching, Crockett, A.O. y C. T. Wittwer, Anal. Biochem. 2001; 290:8997) , y técnicas que utilizan un colorante de ADNdc, en lugar de sondas de oligonucleótidos marcados covalentemente con fluorescencia. Las técnicas de tinción son adecuadas porque no precisan sondas de oligonucleótidos con marcaje, con lo que se reduce el tiempo de diseño y el coste de los ensayos.

Se han publicado dos técnicas para clasificar SNP mediante la utilización de colorantes de ADNdc. Se puede utilizar amplificación específica de alelo en presencia de colorantes de ADNdc para genotipar con PCR en tiempo real

(Germer S, y otros, Genome Research 2000; 10:258-266) . Según el método de la referencia de Germer, dos cebadores específicos para un alelo se diferencian en su base 3’ y amplifican de forma diferencial un alelo o el otro en presencia de un cebador antisentido común. A pesar de que no se necesitan oligonucleótidos marcados con fluorescencia, para el genotipado se precisan tres cebadores y dos pocillos para cada genotipo de SNP. Además, es necesario un instrumento de PCR en tiempo real para hacer un seguimiento de la fluorescencia en cada ciclo.

El otro método basado en tinción no precisa de un seguimiento en tiempo real, solamente necesita un pocillo por cada genotipo SNP y utiliza el análisis de fusión (Germer S, y otros, Genome Research 1999; 9:72-79) . En este método también se utiliza la amplificación específica de alelo, que precisa de tres cebadores, tal y como sucedía con el método Germer citado previamente. Además, uno de los cebadores incluye cola de anclaje GC (“GC-clamp tail”) para aumentar la temperatura de fusión del amplicón, permitiendo así la diferenciación mediante temperatura de fusión en un pocillo, Se hace un seguimiento de la fluorescencia tras la amplificación mediante PCR, y la adquisición en tiempo real no es necesaria.

CARACTERÃ?STICAS DE LA INVENCIÓN

En un aspecto que no pertenece a la presente invención, se da a conocer un método que solamente precisa de una mezcla de PCR estándar, comprendiendo reactivos, cebadores, y simplemente la adición a la PCR de un colorante de unión al ADN (dc) de doble cadena “saturante” o un nuevo colorante de unión a ADNdc según esta divulgación. Para finalidades de la presente divulgación, un colorante “saturante” es un colorante que no inhibe significativamente la PCR cuando se encuentra en concentraciones que proporcionan una señal de fluorescencia máxima en el caso de la cantidad de ADNdc que se genera normalmente mediante una PCR en ausencia de colorante, a modo de ejemplo, de aproximadamente 10 ng/μl. A pesar de que los colorantes se identifican mediante su compatibilidad con el procedimiento de PCR a concentraciones cercanas a la saturación, se da por supuesto que dichos colorantes se pueden utilizar a concentraciones muy inferiores. Durante o tras el proceso de amplificación, los colorantes se pueden utilizar para distinguir heterodúplex de homodúplex mediante el análisis de la curva de fusión de un modo similar a como se utiliza el marcaje de los cebadores. (Gundr y CN, y otros, Clin Chem. 2003 Mar; 49 (3) :396-406) . La identificación de heterodúplex y homodúplex se puede utilizar en diversos análisis, entre ellos el estudio de mutaciones y el genotipado. El término “cribado” describe el proceso en el cual el fragmento de ácido nucleico se compara con un fragmento de ácido nucleico de referencia para buscar diferencias entre las secuencias. Una respuesta positiva que indica una diferencia en la secuencia puede no mostrar la naturaleza de la modificación de la secuencia o su posición dentro del fragmento de ácido nucleico. El término “genotipado” incluye la detección y determinación de variaciones en la secuencia... [Seguir leyendo]

1. Compuesto con la fórmula:

en la que

el residuo representa un anillo aromático monocíclico o policíclico fusionado opcionalmente sustituido o un anillo heteroaromático que contiene nitrógeno monocíclico o policíclico fusionado opcionalmente sustituido; 10 X es oxígeno, azufre, selenio, telurio o un residuo seleccionado entre C (CH3) 2 y NR1, en el que R1 es hidrógeno o alquilo C1-6; R2

se selecciona del grupo que comprende alquilo C1-6, cicloalquilo C3-8, arilo, arilo (alquilo C1-3) , hidroxialquilo, alcoxialquilo, aminoalquilo, mono y dialquilaminoalquilo, trialquilamonioalquilo, alquilenocarboxilato, alquilenocarboxamida, alquilenosulfonato, residuos que contienen un heteroátomo cíclico opcionalmente sustituido,

o residuos que contienen un heteroátomo acíclico opcionalmente sustituido; t =0ó 1; Z es la carga seleccionada entre 0 y 1; R3, R9 y R10 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-6 y arilcarbonilo; n =0, 1ó 2; y

Q es un heterociclo del grupo de estructuras que comprende:

en el que R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que comprende hidrógeno, halógeno, alquilo,

cicloalquilo, heteroalquilo, heterocicloalquilo, alquenilo, polialquenilo, alquinilo, polialquinilo, alquenilalquinilo, alquilnitriltio, arilo, heteroarilo, alcoxi, alquiltio, ariltio, arilcarboniltio, dialquilamino, cicloheteroalquilcarboniltio, dialquilaminoalquilcarboniltio, trialquilamonioalquilcarboniltio, cicloalquiltio, cicloheteroalquiltio, trialquilamonioalquiltio, y nucleosidiltio, cada uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente; un residuo que contiene un heteroátomo acíclico, o un residuo que contiene un heteroátomo cíclico, una unión PUENTE-COLORANTE con la fórmula siguiente:

en el que el PUENTE es un enlace covalente simple, o un enlace covalente lineal o ramificado, cíclico o heterocíclico, saturado o insaturado, que comprende 1-16 átomos diferentes al hidrógeno, tales como carbono, nitrógeno, fosfato,

oxigeno, y azufre, de tal forma que la unión contiene cualquier combinación de enlaces alquilo, éter, tioéter, amina, éster, o amida; enlaces carbono-carbono simples, dobles, triples o aromáticos; enlaces fósforo-oxígeno, fósforoazufre, nitrógeno-nitrógeno o nitrógeno-oxígeno; o enlaces aromáticos o heteroaromáticos; y un grupo reactivo seleccionado entre halógenos, hidroxi, alcóxidos, aminas, ácidos carboxílicos, haluros, alcoholes, aldehídos, tioles, alquilo, y ariltioles, alquil y arilsulfonilos, ésteres succinimidilos, cetonas e isotiocianatos;

cada uno de los cuales comprende opcionalmente un residuo de amonio cuaternario, y R4 se selecciona del grupo que comprende arilcarboniltio, cicloheteroalquilcarboniltio, dialquilaminoalquilcarboniltio; trialquilamonioalquilcarboniltio, cicloalquiltio, cicloheteroalquiltio, trialquilamonioalquiltio, alquilnitriltio, y nucleosidiltio, cada uno de los cuales puede estar sustituido opcionalmente.

2. Compuesto, según la reivindicación 1, con la fórmula:

3. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que el compuesto se selecciona entre el grupo que comprende N7, 07, P7, Q7, R7, S7, T7, V7, W7, X7, T8, A9, C9, I9, I9Met, J9, J9Met, L9, L9Met, M9, N9, O9, R9 y V10 de la tabla 2.