Células progenitoras hepáticas humanas y métodos de uso de las mismas.
Una población de células aisladas consistente en células derivadas de tejido hepático de un ser humano que son
a.
CD117+, CD34+, CD45- y Lin-;
b. capaces de proliferar en un cultivo y
c. capaces de diferenciarse in vivo en un hepatocito, un colangiocito y una célula sinusoidal.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2005/000660.
Solicitante: NOVAHEP AB.
Nacionalidad solicitante: Suecia.
Dirección: DROTTNINGGATAN 33, BOX 7710 103 95 STOCKHOLM SUECIA.
Inventor/es: HOLGERSSON,Suchitra.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K35/12 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 35/00 Preparaciones medicinales que contienen sustancias de constitución indeterminada o sus productos de reacción. › Sustancias procedentes de mamíferos; Composiciones que comprenden tejidos o células indeterminadas; Composiciones que comprenden células madre no embrionarias; Células modificadas genéticamente (vacunas o preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00).
- A61K35/407 A61K 35/00 […] › Hígado; Hepatocitos.
- A61P1/16 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › A61P 1/00 Medicamentos para el tratamiento de trastornos del tracto alimentario o del aparato digestivo. › para el tratamiento de trastornos de la vesícula biliar o del hígado, p.ej.protectores hepáticos, colagogos, litolíticos.
- C12N5/071 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células o tejidos de vertebrados, p.ej. células o tejidos humanos.
- C12N5/074 C12N 5/00 […] › Células madre adultas.
- C12Q1/02 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen microorganismos vivos.
- G01N33/50 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
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Fragmento de la descripción:
Celulas progenitoras hepaticas humanas y metodos de uso de las mismas CAMPO DE LA INVENCION
La invención se refiere a celulas progenitoras.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La insuficiencia hepatica aguda sigue siendo un problema importante de alta mortalidad. A pesar de la alta incidencia de enfermedades que dan como resultado disfunción e insuficiencia hepatica, los principales avances de las terapias medicas estan actualmente limitados a la prevención y el tratamiento de ciertas formas de hepatitis virica. Las enfermedades hepaticas agudas y crónicas siguen tratandose con enfoques sintomaticos en lugar de curativos. El transplante hepatico ortot6pico ha sido hasta ahora la unica terapia disponible para pacientes con insuficiencia hepatica terminal. Desgraciadamente, la disponibilidad de órganos donantes es limitada y muchos pacientes mueren cada ano esperando transplantes de higado. Recientemente, se ha usado como terapia alternativa el transplante de hepatocitos sanos a higado enfermo. Sin embargo, la escasez de donantes de órganos ha limitado la aplicación clinica del transplante de celulas hepatociticas.
La terapia celular con citoblastos y su progenie es un nuevo y prometedor enfoque para la necesidad medica ampliamente insatisfecha en pacientes con enfermedades hepaticas. Una serie de estudios han examinado el potencial del transplante de citoblastos/celulas progenitoras (obtenidos de tejidos extrahepaticos e intrahepaticos) en insuficiencia hepatica aguda inducida experimentalmente. Aunque los citoblastos/celulas progenitoras de órganos adultos pueden generar celulas hepaticas funcionales, dichas celulas son escasas. Beneficiarian en gran medida la capacidad de producir grandes cantidades de estas celulas que retuviesen sus funciones definitivas completas protocolos terapeuticos clinicos que implicaran el transplante de celulas progenitoras hepaticas para mejorar enfermedades heredadas y adquiridas.
Por tanto, existe la necesidad de una fuente de celulas progenitoras hepaticas que puedan diferenciarse en celulas hepaticas funcionales.
SUMARIO DE LA INVENCION
La invención esta basada en el descubrimiento de una celula progenitora hepatica. La celula progenitora es multipotente. La celula progenitora es capaz de diferenciarse in vivo en un hepatocito, colangiocito o celula endotelial hepatica (concretamente, una celula sinusoidal) . Por consiguiente, la invención proporciona una población celular aislada como se define en la reivindicación 1. La población es un cultivo de adhesión. Como alternativa, las celulas de la población estan en suspensión. La celula deriva de tejido hepatico, tal como tejido hepatico fetal. El tejido es de un ser humano. La celula es inmunorreactiva con CD117 y CD34 y no inmunorreactiva con Lin. Las celulas proliferan in vitro. Las celulas son capaces de duplicarse 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25 o mas veces y mantener su capacidad de diferenciarse en hepatocitos, colangiocitos o celulas endoteliales hepaticas.
Se proporcionan tambien metodos de producción de un hepatocito o colangiocito hepatico humano o una celula sinusoidal hepatica humana mediante la diferenciación de cultivos de celulas progenitoras hepaticas en un medio de cultivo que contenga uno o mas factores de diferenciación como se definen en las reivindicaciones 5 y 6. Los factores de diferenciación incluyen factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y factor de crecimiento epidermico (EGF) .
La invención expone adicionalmente el uso de una celula progenitora hepatica multipotente que es CD117+, CD34+, CD45- y Lin- en la fabricación de una composición para transplante a un hospedador, por ejemplo, un mamifero tal como un ser humano, primate, ratón, rata, perro, gato, vaca, caballo o cerdo. Opcionalmente, se cotransplantan al hospedador celulas estromaticas hepaticas fetales o celulas mesenquimaticas hepaticas fetales. El uso de celulas derivadas de embriones humanos no esta comprendido. Se administra al hospedador factor de crecimiento de hepatocitos antes, despues o concomitantemente con las celulas progenitoras. El hospedador padece un trastorno 45 hepatico o dano de tejido hepatico. Por ejemplo, el sujeto padece hepatitis, cirrosis, cancer hepatico, esteatosis hepatica, sindrome de Reye, enfermedad de almacenamiento de gluc6geno, quistes hepaticos o enfermedad de Wilson. El transplante confiere un beneficio clinico, por ejemplo, aliviar uno o mas sintomas del trastorno hepatico particular. Los trastornos hepaticos se diagnostican por un medico usando metodos conocidos en la materia.
Se identifican los compuestos que afectan a la proliferación, diferenciación o supervivencia de celulas hepaticas 50 poniendo en contacto el cultivo de celulas progenitoras hepaticas con un compuesto de ensayo y determinando si el compuesto tiene efecto sobre la proliferación, diferenciación o supervivencia de las celulas. De forma similar, se determina el metabolito de un compuesto de ensayo. Los metabolitos se identifican cribando el medio de cultivo despues de poner en contacto el cultivo con el compuesto de ensayo. Los metabolitos se identifican mediante metodos conocidos en la materia tales como HPLC, espectroscopia de masas o electroforesis en gel. La actividad 55 antivirica de un compuesto de ensayo se determina introduciendo un virus en un cultivo de celulas progenitoras en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo y determinando la tasa de supervivencia de las celulas. Un
aumento de la tasa de supervivencia en presencia del compuesto de ensayo en comparación con en ausencia del compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo tiene actividad antivirica. La infectividad de un virus se determina poniendo en contacto un cultivo de celulas progenitoras con un virus y determinando el efecto sobre la proliferación o supervivencia de las celulas. Una reducción de la supervivencia o proliferación en comparación con un cultivo celular que no se ha puesto en contacto con el virus indica que el virus puede infectar celulas hepaticas. En contraposición, una similitud de la supervivencia o proliferación en comparación con un cultivo celular que no se ha puesto en contacto con el virus indica que el virus no infecta celulas hepaticas.
Opcionalmente, el cultivo se diferencia antes de poner en contacto el cultivo con un compuesto de ensayo. La proliferación o supervivencia se determinan mediante metodos conocidos en la materia tales como el ensayo de BrdU. La diferenciación se determina morfológica o histológicamente determinando marcadores de superficie celular hepatica. El virus es un virus trófico hepatico tal como virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B o virus de la hepatitis C.
A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un especialista en la materia a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la practica o ensayo de la presente invención, se describen los metodos y materiales adecuados a continuación. En caso de conflicto, prevalecera la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
Resultaran evidentes otros rasgos y ventajas de la invención a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 es una serie de analisis por FACS y fotografias que muestran la caracterización de celulas progenitoras hepaticas humanas: a, las celulas de HF clasificadas magneticamente inmediatamente despues del aislamiento se tenian doblemente por CD117 y CD34, pero negativamente por CD90, CD45, albumina y citoqueratina 19 (CK19) ; b, las celulas CD117+/CD34+/Lin-crecian en colonias al cultivarse, y el primer marcador en expresarse era el receptor de factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) , n° de aumentos: 40x; c, las celulas recien aisladas y propagadas en diversos pases daban lugar a ALB-CK19- (flecha blanca) , ALB+ (verde) , CK19+ (rojo) , ALB+CK19- (verde, hepatocitos) y ALB-CK19+ (rojo, colangiocitos) , n° de aumentos: 60x; d, las celulas adherentes CD117+/CD34+/Linclasificadas magneticamente, cuando se cultivaban en medio de cultivo que contenia factor de crecimiento endotelial vascular, se diferenciaban en celulas endoteliales Flk-1+ (-50%) , colangiocitos CK19+ (-13%) y hepatocitos albumina+ (-17%) . Aproximadamente... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Una población de celulas aisladas consistente en celulas derivadas de tejido hepatico de un ser humano que son
-
a. CD117+, CD34+, CD45-y Lin;
b. capaces de proliferar en un cultivo y
c. capaces de diferenciarse in vivo en un hepatocito, un colangiocito y una celula sinusoidal.
2. La población celular aislada de la reivindicación 1, en la que la población es capaz de duplicarse al menos 6 veces.
3. La población celular aislada de la reivindicación 1, en la que la población es capaz de duplicarse al menos 12 veces.
4. La población celular aislada de la reivindicación 1, en la que dicha población es un cultivo de adhesión.
5. Un metodo de producción de una celula sinusoidal hepatica humana in vitro que comprende
-
a. proporcionar una suspensión celular que comprende una celula CD117+, CD34+ y Lin;
b. cultivar la suspensión celular y
c. diferenciar la progenie celular en un medio de cultivo que contiene factor de crecimiento endotelial vascular.
6. Un metodo de producción de un hepatocito o colangiocito hepatico humano in vitro que comprende:
-
a. proporcionar una suspensión celular que comprende una celula CD117+, CD34+ y Lin;
b. cultivar la suspensión celular y
c. diferenciar la progenie celular en un medio de cultivo que contiene EGF y HGF.
7. Un metodo de producción de una población de celulas progenitoras hepaticas humanas que se diferencian in vivo en hepatocitos, colangiocitos y celulas sinusoidales, que comprende seleccionar de una población de celulas
-
derivadas de higado humano las celulas que son CD117+, CD34+, CD45-y Lin.
8. Uso de una celula progenitora hepatica multipotente que comprende proporcionar un cultivo celular in vitro que comprende celulas progenitoras hepaticas CD117+, CD34+, CD45-y Lin-humanas multipotenciales, en el que dichas celulas mantienen la capacidad multipotencial de diferenciarse en hepatocitos, colangiocitos o celulas sinusoidales, para la fabricación de una composición para transplante a un hospedador.
9. El uso de la reivindicación 8, en el que el transplante comprende adicionalmente el cotransplante de celulas estromaticas hepaticas fetales o celulas mesenquimaticas hepaticas fetales a dicho hospedador, excluyendo el uso de embriones humanos.
10. El uso de la reivindicación 8, en el que el transplante comprende adicionalmente administrar a dicho hospedador factor de crecimiento de hepatocitos.
DETECCION DE FVIII HUMANO EN RATONES DE HiGADO DAºADO TRANSPLANTADOS CON CELULAS PROGENITORAS HEPATICAS HUMANAS
RATONES Nº DE RATONES DETECCION DE FVIII HUMANO ng/m1 C57/BL ATºMICOS NORMALES 19 ± 2, 6 LESIºN HEPºTICA + HEPATECTOMºA DE CºLULAS NO HUMANAS 8 15 ± 3, 9 LESIºN HEPºTICA + HEPATECTOMºA +HGF/CºLULAS ESTROMºTICAS 8/8 20 ± 5, 1 / 35 ± 10, 2 LESIºN HEPºTICA + HEPATECTOMºA +HPC 66 ± 15 LESIºN HEPºTICA + HEPATECTOMºA + HGF + CºLULAS ESTROMºTICAS + HPC 121 ± 36FIG. 6
EXPRESION DE MARCADORES HEMATOPOYETICOS, HEPATICOS Y PANCREATICOS EN HiGADOS FETAL Y ADULTO
ANTICUERPOS DE % DE CELULAS DE HF DE 9 SEM % DE CELULAS DE HF DE 18 SEM % DE CELULAS DE HiGADO ADULTO CD117 0, 9 ± 0, 2 15 ± 1, 5 0, 003 ± 0, 001 CD90 0, 5 ± 0, 3 12 ± 5, 5 0, 002 ± 0, 001 CD34 2 ± 0, 3 30 ± 7, 5 0, 04 ± 0, 01 CD123 1 ± 0, 05 12 ± 5, 6 0, 03 ± 0, 02 CD133 0, 3 ± 0, 04 16 ± 7, 0 0, 002 ± 0, 001 Flk-1 ± 4, 0 8 ± 3, 0 1 ± 0, 05 Flt-1 2 ± 0, 2 20 ± 4 0, 002 ± 0, 001 Tle-2 0, 1 ± 0, 02 8 ± 3 0 ALBUMINA 0 15 ± 2, 4 60 ± 10 AG. HEPATOCºTICO 0 10 ± 2, 2 0, 004 ± 0, 001* HEA-125 0 10 ± 2, 0 6 ± 2 CK19 0 5 ± 2, 4 6 ± 2 c-Met 0, 02 ± 0, 01 5 ± 2, 3 70 ± 6 a-FETOPROTEºNA 9 ± 0, 4 26 ± 7, 9 0, 008 ± 0, 004 CD45 4 ± 2, 2 12 ± 5, 3 20 ± 5 CD14 3 ± 2, 0 5 ± 3, 9 3 ± 0, 7 Gly A 70 ± 20 50 ± 10 10 ± 5 HLA DE CLASE I 4 ± 2, 4 6 ± 3 70 ± 5 HLA DE CLASE II 2 ± 1, 3 2 ± 1, 3 10 ± 5 NESTINA 4 ± 2, 3 6 ± 2 2 ± 0, 4 AMILASA 4 ± 3, 5 16 ± 4 5 ± 5, 6 INSULINA 0, 5 ± 0, 1 2 ± 1, 5 0, 002 ± 0, 001 POLIPºPTIDO PANCREºTICO 4 ± 3 18 ± 3 6 ± 1 GLUCAGºN 4 ± 2, 3 15 ± 3 5 ± 3, 5FIG. 7
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