CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES AISLADAS A PARTIR DE SANGRE PERIFÉRICA.

La presente invención se relaciona con células madre mesenquimales (CMM) aisladas a partir de la sangre periférica,

caracterizadas porque expresan el receptor alfa-2 de la interleuquina 13 (IL 13RA2), así como con un método para aislar dichas CMM que comprende detectar la expresión de dicho IL13RA2 en células de una muestra de sangre periférica, y, si se desea, aislar dichas células que expresan IL13RA2.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201031821.

Solicitante: INSTITUTO DE SALUD CARLOS III..

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: GARCIA CASTRO,JAVIER, RODRIGUEZ GONZALEZ,RENE, RUBIO AMADOR,RUTH, BLANCO MORÓN,Armando, MARIÑAS PARDO,Luis Antonio, RODRÍGUEZ MILLA,Miguel Ángel, CUBILLO MORENO,Isabel María, GARCÍA ALCALDE,Fernando, MASIP ORDÓÑEZ,Manuel.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N5/0789 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células madre; Células progenitoras multipotentes.

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Fragmento de la descripción:

CÉLULAS MADRE MESENOUIMALES AISLADAS A PARTIR DE SANGRE

PERIFÉRICA

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con células madre mesenquimales (CMM) aisladas a partir de la sangre periférica, o de sus hemoderivados, caracterizadas porque expresan el receptor alfa-2 de la interleuquina 13 (IL13RA2) , Y con sus aplicaciones. La invención también se relaciona con un método para aislar dichas CMM basado en la detección del marcador IL13RA2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Un tipo de células madres adultas especialmente prometedor en aplicaciones terapéuticas es el formado por las denominadas células madre mesenquimales (CMM) . Las CMM son células madre pluripotentes progenitoras que han sido aisladas de médula ósea, tejido adiposo, cartílago, piel, músculo, hueso, sangre periférica y otros tejidos. Estas células tienen un potencial uso médico en la regeneración de tejidos ya que las CMM aisladas y expandidas en cultivo son capaces de diferenciarse a osteoblastos, condrocitos, miocitos y adipocitos, entre otros tipos celulares, y pueden ser reintroducidas posteriormente en el cuerpo humano para reparar tejidos perdidos o dañados. Otra característica aún más valiosa en la práctica clínica es su capacidad de inmunomodulación, 10 que les hace tremendamente útiles para enfermedades de base mmune.

La diferenciación de las CMM no es sólo un hecho descrito in vitro, sino que en diversos modelos animales de daño tisular se ha observado cómo, en la zona dañada, aparecían células no hematopoyéticas de la médula ósea o bien directamente CMM, y que estas células eran capaces de diferenciarse hacia el linaje celular del tejido donde anidaban (piel, cerebro, hígado, etc) (Prockop DJ et al. 2003. Proc Natl Acad Sci USA., 100: 11917-11923) . Esto demuestra el potencial de las CMM para reparar y regenerar múltiples órganos gracias a su capacidad de movilizarse desde sus reservorios naturales hasta la sangre periférica, y de ahí extravasarse hacia el lugar donde se localiza el daño.

Esta movilización implica la presenCIa de CMM en sangre, al menos de forma transitoria. Efectivamente, diversos artículos han mostrado la posibilidad de aislar CMM de sangre periférica, de sangre de cordón umbilical e incluso de sangre fetal (Zvaifler NJ et al. 2000. Arthritis Research, 2:477-488; y He Q et al. 2007, Stem Cells; 25:69-77) .

Una barrera para el estudio y la aplicación terapéutica de estas células es la dificultad de aislar CMM de sangre periférica con los métodos disponibles en la actualidad (Roufosse CA et al. 2004 International Journal Biochemistr y Cell Biology, 36:585-597) . El cultivo de CMM de sangre periférica también es poco reproducible, ya que sólo en un pequeño porcentaj e de las muestras se consigue, por los métodos tradicionales, obtener y expandir durante meses poblaciones enriquecidas en CMM (Ramírez M et al. 2006. British Journal Sports Medicine, 40:719-22; GarcÍa-Castro J et al. 2007, Journal Pediatric Hematology Oncology, 29:388-392) .

En la actualidad el proceso de obtención y purificación de CMM de diversos tejidos sólidos se basa en el mismo principio, la adherencia innata de las CMM al plástico. En general, tras disgregar el tejido y obtener una muestra de células en suspensión se obtiene una fracción enriquecida en células mononucleares, utilizando gradientes de densidad, tales como ficoll o percol1. Esta fracción se suele depositar directamente sobre frascos de cultivo celular estándar con medios generalistas a los que se añade suero bovino fetal, y, al día siguiente, se retiran las células no adheridas y se mantiene el cultivo de células adheridas hasta que se enriquece en CMM (Friedenstein AJ et al. 1974 Transplantation, 17:331-340; WO 0183709; WO 0134775; WO 2005121317; WO 2005015151) . Con esta metodología ocasionalmente se pueden obtener CMM de sangre periférica movilizada y con mucha menor probabilidad de sangre periférica no movilizada (Zvaifler NJ et al. 2000, Arthritis Research, 2: 477-488; He Q et al. 2007. Stem Cells, 25: 69-77; Lazarus HM et al. 1995. Bone Marrow Transplantation, 16: 557564; Wexler SA et al. 2003. British Journal Haematology, 121: 368-374; WO 0022097; WO 9901145) .

La solicitud de patente WO 2009/040458 describe un procedimiento de obtención de CMM con capacidad pluripotente que utiliza sangre periférica de mamíferos o sus hemoderivados como fuente celular, y que consiste en la centrifugación en gradiente de densidad de dicha sangre periférica y posterior separación y lavado por centrifugación de la fracción celular mononuc1ear obtenida, resuspendiendo después las células sedimentadas y cultivándolas en unas condiciones determinadas.

Es conocido que las CMM sufren cambios fenotípicos y funcionales cuando dejan la médula ósea para dirigirse a la circulación periférica, 10 que se traduce en un patrón de expresión génico distinto en CMM procedentes de médula ósea y en CMM procedentes de sangre periférica (Conrad C et al. 2008. Stem Cells Dev, 17:23-27) .

Tondreau T Y col. (Tondreau T et al. 2005. Stem Cells, 23:1105-1112) presentan tres métodos para el aislamiento de CMM de sangre periférica y de sangre procedente del cordón umbilical: dos de ellos se basan en la capacidad de dichas células de adherirse al plástico, y, el tercero, en la selección de células CD133+ que consiste en aislar dichas células mediante bolas magnéticas recubiertas de anticuerpo anti-CD133 a partir de la fracción mononuc1ear obtenida tras someter a gradiente de densidad las muestras de sangre periférica. Sin embargo, la fracción separada contiene tanto CMM como células madre hematopoyéticas, por 10 que es necesario cultivar in vitro posteriormente las células aisladas.

Por tanto, existe la necesidad de desarrollar un método de aislamiento de CMM a partir de sangre periférica alternativo a los descritos en el estado de la técnica, que permita aislar CMM a partir de dicha fuente celular de una manera específica, fiable, sencilla y reproducible.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en la identificación del receptor alfa-2 de la interleuquina 13 (IL13RA2) en células madre mesenquimales (CMM) de sangre periférica, o de sus hemoderivados, y en el empleo de dicho IL13RA2 como marcador de dichas CMM.

Por tanto, la presente invención se relaciona con dichas CMM aisladas a partir de sangre periférica, o de sus hemoderivados, que expresan IL 13RA2, Y con un método para aislar dichas CMM basado en la detección de dicho IL13RA2. La invención también se relaciona con los usos y aplicaciones de dichas CMM aisladas procedentes de sangre periférica o de sus hemoderivados.

En un aspecto, la invención se relaciona con una célula madre mesenquimal, aislada, procedente de sangre periférica, o de sus hemoderivados, caracterizada porque expresa IL13RA2.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una población celular aislada que comprende CMM procedentes de sangre periférica, o de sus hemoderivados, que expresan IL13RA2, proporcionadas por la presente invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición de CMM procedentes de sangre periférica, o de sus hemoderivados, en la que, al menos, el 50% de las CMM procedentes de sangre periférica, o de sus hemoderivados, que comprende dicha composición, expresan IL13RA2. En una realización particular, dicha sangre periférica, o sus hemoderivados, proceden de un mamífero, por ejemplo, un ser humano.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende al menos una de dichas CMM procedente de sangre periférica, o de sus hemoderivados, proporcionada por la presente invención, o la población celular aislada de CMM proporcionada por la presente invención, o la composición de CMM procedentes de sangre periférica, o de sus hemoderivados, proporcionada por la presente invención en la que, al menos, el 50% de las CMM procedentes de sangre periférica, o de sus hemoderivados, que comprende dicha composición, expresan IL13RA2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la identificación y/o el aislamiento de CMM a partir de sangre periférica o de sus hemoderivados que comprende detectar la expresión de IL13RA2 en células de una muestra de sangre periférica o de sus hemoderivados y, si se desea, aislar dichas células que expresan IL13RA2. Dicha CMM, aislada, obtenible según dicho método, así como... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una célula madre mesenquimal, aislada, procedente de sangre periférica o de sus hemoderivados, caracterizada porque expresa el receptor alfa-2 de la interleuquina 13 (ILl3RA2) .

2. Célula madre mesenquimal aislada según la reivindicación 1, obtenible mediante un método que comprende detectar el receptor alfa-2 de la interleuquina 13 (TLl3RA2) lOenla superficie de dicha célula y aislar dicha célula que expresa lLl3RA2.

3. Célula madre mesenquimal según la reivindicación 1, caracterizada porque además, expresa uno o más marcadores de membrana plasmática seleccionados del grupo que consiste en CAMK2Nl, CDH10, CLDNll, LSAMP, PSCAy SFRPl.

4. Célula madre mesenquimal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha sangre periférica o hemoderivado es de origen humano.

5. Célula madre mesenquimal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que

la sangre periférica se selecciona del grupo que consiste en sangre periférica fresca o criopreservada, sangre periférica movilizada fresca o criopreservada, sangre periférica movilizada y sin movilizar obtenida por técnicas de aféresis fresca o criopreservada, fracción CD34-fresca o criopreservada obtenida de sangre periférica o sus hemoderivados movilizada, "buffy coats" y cualquiera de sus combinaciones.

6. Célula madre mesenquimal según cualquiera de las reivindicaciones I a 5, en la que la sangre periférica procede de un sujeto al que se le ha administrado un factor de estimulación.

7. Célula madre mesenquimal según la reivindicación 6, en la que el factor de estimulación se selecciona del grupo formado por el factor de crecimiento de colonias de granulocitos (G-CSF) , el factor de crecimiento de colonias

granulomacrofágicas (GM-CSF) , un antagonista del receptor CXCR4, una catecolamina, y sus combinaciones.

8. Una población celular aislada que comprende células madre mesenquimales procedentes de sangre periférica o de sus hemoderivados según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una composición de células madre mesenquimales procedentes de sangre periférica,

o de sus hemoderivados, en la que, al menos, el 50% de las células madre mesenquimales procedentes de sangre periférica, o de sus hemoderivados, que comprende dicha composición son células madre mesenquimales que expresan IL 13RA2 según cualquiera de las reivindicaciones I a 7.

10. Una composición farmacéutica que comprende una célula madre mesenquimal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, una población celular seb>lm la reivindicación 8, o una composición de células madre mesenquimales según la reivindicación 9, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Método in vitro para la identificación y/o el aislamiento de una célula madre mesenquimal a partir de sangre periférica o de sus hemoderivados que comprende detectar la expresión del receptor alfa-2 de la interleuquina 13 (lLI3RA2) en células de una muestra de sangre periférica o de sus hemoderivados y, si se desea, aislar dichas células que expresan TL 13RA2.

12. Método según la reivindicación 11, en el que la sangre periférica utilizada se selecciona del grupo que consiste en sangre periférica fresca o criopreservada, sangre periférica movilizada fresca o criopreservada, sangre periférica movilizada y sin movilizar obtenida por técnicas de aféresis fresca o criopreservada, fracción CD34-fresca o criopreservada obtenida de sangre periférica o sus hemoderivados movilizada, "bufIY coats", y cualquiera de sus combinaciones.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, en el que dicha sangre periférica procede de un sujeto al que se le ha administrado un factor de estimulación.

14. Método según la reivindicación 13, en el que dicho factor de estimulación se selecciona del grupo formado por el factor de crecimiento de colonias de granulocitos (G-CSF) , el factor de crecimiento de colonias granulomacrofágicas (GM-CSF) , un antagonista del receptor CXCR4, una catecolamina, y sus combinaciones.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que dicha sangre periférica o hemoderivado es de origen humano.

16. Uso del receptor alfa-2 de la interleuquina 13 (LL13RA2) como marcador de una célula madre mesenquimal procedente de sangre periférica o de sus hemoderivados.

17. Uso según la reivindicaciónl6, para la identitlcación y/o el aislamiento in vitro de una célula madre mesenquimal a partir de sangre periférica, o de un hemoderivado de la misma, de un sujeto.

18. Uso de un reactivo capaz de detectar el receptor alfa-2 de la interleuquina 13 (ILl3RA2) para la identitlcación y/o el aislamiento de una célula madre mesenquimal a partir de sangre periférica o de sus hemoderivados, en donde dicho reactivo es un anticuerpo que se une especitlcamente a LLI3RA2.

19. Uso de una célula madre mesenquimal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de una población celular según la reivindicación 8, o de una composición de células madre según la reivindicación 9, o de una composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune.

20. Uso de una célula madre mesenquimal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de una población celular set, 'ún la reivindicación 8, o de una composición de

células madre según la reivindicación 9, o de una composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

21. Uso de una célula madre mesenquimal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de una población celular según la reivindicación 8, o de una composición de células madre según la reivindicación 9, o de una composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la preparación de un medicamento para inducir tolerancia al trasplante.

22. Uso de una célula madre mesenquimal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de una población celular según la reivindicación 8, o de una composición de células madre según la reivindicación 9, o de una composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la preparación de un medicamento para la reparación y regeneración de tejidos.

23. Uso de una célula madre mesenquimal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de una población celular según la reivindicación 8, o de una composición de células madre según la reivindicación 9, o de una composición farmacéutica según la reivindicación 10, como sistema de transporte o vehículo de un compuesto biológicamente activo a un sitio de interés.

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Sangre Periférica Cordón Umbilical

., Tejido Adiposo l\1édula Osea

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LISTA DE SECUENCIAS

<110> Instituto de Salud Carlos III

Universidad de Granada Fundación Progreso y Salud <120> Células madre mesenquima1es aisladas procedentes de sangre periférica <130> P5905ESOO

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 380

<212> PRT

<213> Horno sapiens <400> 1

Met Ala Phe Val Cys Leu Ala I1e G1y Cys Leu Tyr Thr Phe Leu I1e 1 5 10 15

Ser Thr Thr Phe G1y Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr G1u I1e Lys Val 20 25 30

Asn Pro Pro G1n Asp Phe G1u I1e Val Asp Pro G1y Tyr Leu G1y Tyr 35 40 45

Leu Tyr Leu G1n Trp G1n Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys G1u 50 55 60

Cys Thr Val G1u Tyr G1u Leu Lys Tyr Arg Asn I1e G1y Ser G1u Thr 65 70 75 80

Trp Lys Thr I1e I1e Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp G1y Phe Asp 85 90 95

Leu Asn Lys G1y I1e G1u Ala Lys I1e His Thr Leu Leu Pro Trp G1n 100 105 110

Cys Thr Asn G1y Ser G1u Val G1n Ser Ser Trp Ala G1u Thr Thr Tyr 115 120 125

Trp I1e Ser Pro G1n G1y I1e Pro G1u Thr Lys Val G1n Asp Met Asp 130 135 140

Cys Val Tyr Tyr Asn Trp G1n Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro G1y 145 150 155 160

Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu

165 170 175 Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly 180 185 190 Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys 195 200 205 Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg 210 215 220 Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro 225 230 235 240 Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu 245 250 255 Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr 260 265 270 Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val 275 280 285 Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu 290 295 300 Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly 305 310 315 320 Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu 325 330 335 Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu 340 345 350 Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr 355 360 365 Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr 370 375 380

 

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