CÉLULAS MADRE ADULTAS MULTIPOTENTES Y PROCEDIMIENTOS PARA SU AISLAMIENTO.

Células madre adultas multipotentes y procedimientos para su aislamiento Campo de la invención La invención se refiere en general a procedimientos para el aislamiento de células madre, células aisladas por los procedimientos y usos terapéuticos para esas células. Más específicamente, la invención se refiere a células progenitoras derivadas de médula aisladas que tienen el potencial de diferenciarse para formar células de diversos linajes celulares, así como a procedimientos para aislar las células y para inducir la diferenciación específica de las células aisladas por el procedimiento, y marcadores específicos que están presentes en estas células tales como proteínas y factores de transcripción. Antecedentes de la invención La generación de órganos y tejidos a partir de células madre y su posterior trasplante proporciona tratamientos prometedores para muchas patologías, haciendo de las células madre un foco central de investigación en muchos campos. El uso de células madre para la generación de órganos y tejido para trasplante proporciona una terapia alternativa prometedora para diabetes, enfermedad de Parkinson, hepatopatía, cardiopatía, y trastornos autoinmunitarios, por nombrar algunas. Sin embargo, existen al menos dos problemas principales asociados con el trasplante de órganos y tejido. En primer lugar, existe una falta de donantes de órganos y tejido. Tan solo un 5 por ciento de los órganos necesarios para trasplantes en los Estados Unidos están siempre disponibles para un receptor. (Evans, y col., J. Am. Med. Assoc. (1992) 267: 239-246.) De acuerdo con la Asociación Americana del Corazón, sólo 2.300 de los 40.000 americanos que necesitaron un corazón nuevo en 1997 recibieron uno, y la Fundación Americana del Hígado informa que existen menos de 3.000 donantes para los casi 30.000 pacientes que mueren cada año de insuficiencia hepática. El segundo problema principal es la incompatibilidad potencial del tejido trasplantado con el sistema inmunitario del receptor. Debido a que el sistema inmunitario del huésped reconoce el órgano o tejido donado como extraño, se deben proporcionar al paciente medicaciones anti-rechazo con un coste significativo tanto financiero como físico. El xenotrasplante o el trasplante de tejido u órganos de otras especies, podría proporcionar un medio alternativo para superar la falta de órganos y tejidos humanos. El xenotrasplante ofrecería la ventaja de la planificación avanzada del trasplante, permitiendo que se recoja el órgano mientras aún está sano y permitiendo que el paciente se someta a cualquier pretratamiento beneficioso antes de la cirugía de trasplante. Desafortunadamente, el xenotrasplante no supera el problema de incompatibilidad del tejido, sino que lo agrava. Además, de acuerdo con los centros para el control de enfermedades, existe evidencia de que los virus dañinos cruzan las barreras entre especies. Los cerdos se han convertido en candidatos probables como donantes de órgano y tejido, aún cuando se ha documentado la transmisión entre especies de más de un virus de cerdos a seres humanos. Por ejemplo, recientemente se sacrificaron más de un millón de cerdos en Malasia en un esfuerzo por contener un brote de virus Hendra, una enfermedad que se transmitió a más de 70 humanos con resultados mortales. (Butler, D., Nature (1999) 398: 549.) Células madre: Definición y uso Por lo tanto, la fuente más prometedora de órganos y tejidos para trasplante radica en el desarrollo de la tecnología de células madre. En teoría, las células madre pueden sufrir una división celular autorrenovadora para dar lugar a células hijas fenotípica y genotípicamente idénticas durante un tiempo indefinido y por último se pueden diferenciar en, al menos, un tipo de célula final. Se pueden generar tejidos para trasplante generando tejidos u órganos a partir de las células madre propias del paciente, o alterando las células heterólogas de modo que el sistema inmunitario del receptor no las reconozca como extrañas, para proporcionar las ventajas asociadas con el xenotrasplante sin el riesgo asociado de infección o de rechazo del tejido. Las células madre también proporcionan una esperanza para la mejora de los resultados del tratamiento génico. Las células madre propias de un paciente se podrían alterar genéticamente in vitro, después reintroducirse in vivo para producir un producto génico deseado. Estas células madre alteradas genéticamente tendrían el potencial de ser inducidas para diferenciarse para formar una multitud de tipos celulares para su implantación en zonas específicas en el organismo, o para su aplicación sistémica. Alternativamente, las células madre heterólogas se podrían alterar genéticamente para expresar el antígeno del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) del receptor, o ningún MHC, para permitir el trasplante de esas células del donante al receptor sin el riesgo asociado de rechazo. Las células madre se definen como células que tienen un potencial de proliferación extenso, algunos dirían indefinido, que las diferencia en varios linajes celulares, y que pueden repoblar tejidos tras el trasplante. La célula madre por excelencia es el embriocitoblasto (ES), ya que tiene un potencial de auto-renovación ilimitado y de diferenciación multipotente. Estas células se derivan de la masa celular interior del blastocisto, o se pueden derivar de células germinativas primigenias de un embrión post-implantación (células germinativas embrionarias o células EG). Se han derivado células ES y EG de ratón, y más recientemente también de seres humanos y primates no humanos. Cuando se introduce en blastocistos de ratón o blastocistos de otros animales, las células ES pueden contribuir a todos los tejidos del ratón (animal). Cuando se trasplanta en animales post-natales, las células ES y EG 2   generan teratomas, lo que demuestra de nuevo su multipotencia. Se pueden identificar células ES (y EG) por tinción positiva con los anticuerpos SSEA1 y SSEA4. A nivel molecular, las células ES y EG expresan una serie de factores de transcripción altamente específicos para esas células no diferenciadas. Estos incluyen oct-4 y Rex-1. También se encontraron los LIF-R y los factores transcripción sox-2 y Rox-1, incluso aunque los dos últimos también se expresan en células no-ES. oct-4 es un factor de transcripción expresado en el embrión pregastrulación, el embrión en la fase de división temprana, las células de la masa celular interior del blastocisto, y en las células de carcinoma embrionario (CE). oct-4 está regulado por disminución cuando se inducen células para diferenciar in vitro y, en el animal adulto, oct-4 sólo se encuentra en células germinativas. Varios estudios han mostrado que se requiere oct-4 para mantener el fenotipo no diferenciado de células ES, y desempeña un papel importante en la determinación de etapas tempranas en embriogénesis y diferenciación, oct-4, en combinación con Rox-1, provoca la activación transcripcional de la proteína Zn-finger Rex-1, y también se requiere para mantener ES en un estado no diferenciado. De forma análoga, se necesita sox-2, junto con oct-4, para mantener el estado no diferenciado de ES/EC y para mantener las células ES murinas (pero no humanas). Las células germinativas humanas o murinas requieren la presencia de LIF. Otro rasgo característico de las células ES es la presencia de telomerasa, que proporciona a estas células un potencial se autorenovación ilimitado in vitro. Se han identificado células madre en la mayoría de los tejidos de órganos. La mejor caracterizada es la célula madre hematopoyética. Esta es una célula derivada del mesodermo que se ha purificado basándose en los marcadores de superficie celulares y en las características funcionales. La célula madre hematopoyética, aislada de la médula ósea, la sangre, la sangre del cordón umbilical, el hígado fetal y el saco vitelino, es la célula progenitora que reinicia la hematopoyesis para la vida de un receptor y genera múltiples linajes hematopoyéticos (véase Fei, R., y cols., patente de los Estados Unidos N.º 5.635.387; McGlave, y cols., patente de los Estados Unidos N.º 5.460.964; Simmons, P., y cols., patente de los Estados Unidos N.º 5.677.136; Tsukamoto, y cols., patente de los Estados Unidos N.º 5.750.397; Schwartz, y cols., patente de los Estados Unidos N.º 759.793; DiGuisto, y cols., patente de los Estados Unidos N.º 5.681.599; Tsukamoto, y cols., patente de los Estados Unidos N.º 5.716.827; Hill, B., ET cols., Exp. Hematol. (1996) 24 (8): 936-943). Cuando se trasplantan en seres humanos o animales letalmente irradiados, las células madre hematopoyéticas pueden repoblar el conjunto de células hematopoyéticas eritroides, neutrófilosmacrófagos, megacariocitos y linfoides. In vitro, se pueden inducir... [Seguir leyendo]

1. Una célula de línea celular no germinativa, no embrionaria, multipotente humana aislada, en la que la célula expresa los factores de transcripción oct 4, REX-1 y ROX-1 y en la que se puede inducir la célula para diferenciarse en tipos celulares de origen endodérmico, ectodérmico y mesodérmico. 2. La célula de la reivindicación 1, (a) en la que el tipo de célula mesodérmica es osteoblasto, condrocito, adipocito, fibroblasto, estroma de la médula, músculo esquelético, músculo liso, músculo cardíaco, endotelial, epitelial, hematopoyético u óseo; y/o (b) en la que el tipo de célula ectodérmica es glial, neuronal u oligodendrocito. 3. La célula de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la célula se deriva de un órgano. 4. La célula de la reivindicación 3, en la que el órgano es médula, hígado o cerebro. 5. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en medicina. 6. La célula de la reivindicación 5, para su uso para corregir un proceso de enfermedad genética, enfermedad degenerativa, enfermedad cardiovascular, enfermedad de almacenamiento metabólico, enfermedad neuronal o de cáncer o en el tratamiento de enfermedad autoinmunitaria. 47   48   49     51   52   53   54 ESQUELÉTICO   CULTIVARON CONJUNTAMENTE LAS CÉLULAS DURANTE 2 DÍAS Y DESPUÉS SE EXAMINARON POR MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA   56   57   58   59     61   2 SEMANAS 6 SEMANAS 62   63