Células de fucosilación deficiente.

Una célula que es capaz de fucosilar una glicoproteína, donde la célula comprende un gen de la GDP-4-ceto-6- desoxi-manosa-3,

5-epimerasa-4-reductasa (FX) modificada que tiene una modificación que codifica una proteína FX que es al menos un 90 % idéntica a la SEC ID Nº 1 y que comprende una serina en la posición 289, y donde no más del 10 % de la glicoproteína está fucosilada cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 ºC en ausencia de una fuente de fucosa externa.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/036914.

Solicitante: REGENERON PHARMACEUTICALS, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 777 OLD SAW MILL RIVER ROAD TARRYTOWN, NY 10591 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: FANDL, JAMES, P., CHEN,GANG, BURAKOV,DARYA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K16/00 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales.
  • C12N15/53 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Oxidorreductasas (1).
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
  • C12N9/04 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
  • C12P21/00 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00).

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Ilustración 1 de Células de fucosilación deficiente.
Ilustración 2 de Células de fucosilación deficiente.
Ilustración 3 de Células de fucosilación deficiente.
Ilustración 4 de Células de fucosilación deficiente.
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Células de fucosilación deficiente.

Fragmento de la descripción:

Células de fucosilación deficiente Campo

La invención se refiere a una enzima de mamíferos modificada en la ruta de fucosilación, donde las células portadoras de la enzima de mamíferos modificada exhiben una capacidad reducida para fucosilar una proteína y a células que comprenden una modificación genética que tiene como resultado una capacidad reducida para fucosilar una proteína. La invención incluye una línea de células de mamífero (p. ej., líneas CHO) que expresa proteínas, incluidos anticuerpos, con una fucosilación reducida en comparación con las líneas celulares salvajes. La invención también se refiere a un control condicional de la fucosilación de proteínas.

Antecedentes

En la técnica se conocen líneas celulares que son incapaces de fucosilar proteínas. Se conocen numerosos mutantes de pérdida de función que son incapaces de fucosilar proteínas, quizá las más importantes determinadas mutantes de células de ovario de hámster chino (CHO) seleccionadas por la resistencia a determinadas lecitinas. Dichas líneas celulares se aíslan mediante selección repetida de la incapacidad para unirse a una lectina concentrada, por ejemplo la lectina Lens culinaris, en presencia de un mutágeno. Se conocen otras líneas celulares supuestamente incapaces de fucosilar proteínas, por ejemplo anticuerpos, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 7.425.466 y la patente de EE.UU. 7.214.775 (a1, 6-fucosiltransferasa, es decir la muíante FUT8). El documento EP- A1-1.331.266 (Kyowa Hakko Kogyo KK) se refiere a células productoras de composiciones de anticuerpos. Sigue existiendo la necesidad en la técnica de líneas celulares con menor capacidad para fucosilar proteínas, en particular de células con menor capacidad de fucosilación en ausencia de un defectivo y de células que fucosilan de forma condicional proteínas.

Resumen

La proteína GDP-4-ceto-6-desoxi-manosa-3,5-epimerasa-4-reductasa (FX) modificada usada comprende una modificación 289S y es al menos un 9 % idéntica a la SEC ID N° 1. En una realización, la proteína FX comprende una modificación 289S y al menos una modificación seleccionada del grupo que consiste en 79S, 9K, 136L, 211R, y una combinación de los mismos.

En un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína FX, donde la proteína FX comprende una serina en la posición 289 y donde la proteína FX es al menos un 9 % idéntica a la SEC ID N° 1. En una realización específica, el ácido nucleico es a.C. En una realización, se proporciona un vector de expresión o un vector dirigido que comprende el ácido nucleico. En una realización, el ácido nucleico del vector dirigido comprende un intrón. En una realización, el ácido nucleico del vector dirigido comprende un ADNc que codifica la proteína FX modificada. En una realización específica, el vector dirigido comprende una secuencia dirigida que dirige al vector hacia un locus en un genoma humano, de primate no humano, de hámster, de ratón o de rata.

En un aspecto, se proporciona una célula que es capaz de fucosilar una glicoproteína, donde la célula comprende un gen de la GDP-4-ceto-6-desoxi-manosa-3,5-epimerasa-4-reductasa (FX) modificada que tiene una modificación que codifica una proteína FX que es al menos un 9 % idéntica a la SEC ID N° 1 y que comprende una serina en la posición 289, y donde no más del 1 % de la glicoproteína está fucosilada cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 °C en ausencia de una fuente de fucosa externa. En una realización, la célula no expresa o no expresa sustancialmente una proteína FC salvaje. En una realización específica, la célula exhibe no más del 1 %, no más del 5 %, no más del 2 % o no más del 1 % de la proteína FX salvaje en comparación con una célula que carece de la modificación.

En una realización, la célula que comprende la proteína FX modificada o el ácido nucleico expresa una glicoproteína que contiene Fe, donde la célula fucosila no más del 9 %, no más del 95 %, no más del 96 %, no más del 97 %, no más del 98 % o no más del 99 % de la glicoproteína en comparación con una célula que carece de la modificación.

En un aspecto, la célula proporcionada comprende una modificación en un ácido nucleico que codifica una proteína FX o que expresa una proteína FX con una modificación, donde la célula carece o carece sustancialmente de la capacidad para fucosilar una glicoproteína a una primera temperatura, pero no carece o no carece sustancialmente de la capacidad para fucosilar la glicoproteína a una segunda temperatura.

En una realización, la primera temperatura es de aproximadamente 37 °C. En una realización, la segunda temperatura es de aproximadamente 34 °C.

En una realización, la capacidad para fucosilar la glicoproteína a la primera temperatura es de aproximadamente 1 % a aproximadamente 1 % de la capacidad para fucosilar la glicoproteína exhibida por una célula que carece de la

modificación. En una realización, la capacidad para fucosilar la glicoproteína a la segunda temperatura es de aproximadamente 7 %, 8 %, 9 % o más en comparación con la capacidad para fucosilar la glicoproteína por una célula que carece de la modificación.

La modificación de la proteína FX usada comprende una sustitución de aminoácido que es 289S y que puede proporcionarse en combinación con cualquiera de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 9K, 211R, 136L, 79S.

En una realización, la proteína FX procede de un primate no humano (p. ej., Macaca mulatta), un ser humano, un ratón (p. ej., Mus musculus), una rata (p. ej., Rattus norvegicus) o un hámster (p. ej., hámster chino o Cricetulus griseus). En una realización específica, la proteína FX comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° 1, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5 o SEC ID N° 6, y porta una o más modificaciones (p. ej., sustituciones de aminoácidos) como se describe en el presente documento. La proteína FX tiene una identidad de secuencia de al menos un 9 % con la SEC ID N° 1.

El ácido nucleico codifica una proteína FX que es al menos un 9 % o al menos un 95 % idéntica a la secuencia de la SEC ID N° 1 y comprende 289S y también puede comprender uno o más de los siguientes aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 79S, 9K, 136L, 211R y 289S, los siguientes aminoácidos en una o más de las posiciones siguientes: 79S, 9K, 136L y 211R.

En una realización, el ácido nucleico codifica una FX que es al menos un 95 % idéntica a la FX de la SEC ID N° 2. En una realización específica, la FX tiene la secuencia de aminoácidos de la SE ID N°2.

[Eliminado]

En una realización, la célula expresa una enzima de la ruta de fucosilación salvaje seleccionado del grupo que consiste en GDP-manosa 4,6-deshidratasa (GMD), una GDP-(3-L-fucosa pirofosforilasa (GFPP) salvaje, una a-1,6- fucolisiltransferasa (FUT8) salvaje y una combinación de los mismos.

En un aspecto, la célula es una célula de mamífero capaz de fucosilar una proteína, donde la célula comprende una modificación en un gen FX, donde la modificación tiene como resultado una reducción de al menos un 9 % en la capacidad de la célula para fucosilar una proteína en comparación con una célula que carece de la mutación o alteración.

En una realización, la reducción es de aproximadamente 9 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en comparación con una célula de mamífero que no contiene la modificación.

En una realización, la comparación de una célula modificada de acuerdo con la invención y una célula que no comprende la modificación se realiza en las mismas condiciones o esencialmente en las mismas condiciones (p. ej., medio, temperatura, densidad celular etc.).

En una realización, la célula se selecciona de una célula COS, CHO, 293, BHK, HeLa, Vero, una célula de mamífero transfectada con genes de adenovirus, por ejemplo AD5 E1, incluyendo, entre otras, una célula de retina humana inmortalizada transfectada con un gen de adenovirus, por ejemplo una célula PER.C6 y una célula NSO. En una realización, la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO). En una realización específica, la célula CHO es una célula CHO K1.

La modificación es 289S. En una realización específica, la sustitución comprende 289S y una o más de 79S, 9K, 136L y 211R.

En una realización, la célula comprende un gen FX que codifica una proteína que comprende la secuencia de SEC ID N° 1, con la sustitución de aminoácido L289S. En una realización específica, la sustitución de aminoácido comprende L289S y una o más de N79S, N9K, P136L, y G211R.

En una realización,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una célula que es capaz de fucosilar una glicoprotefna, donde la célula comprende un gen de la GDP-4-ceto-6- desoxi-manosa-3,5-epimerasa-4-reductasa (FX) modificada que tiene una modificación que codifica una proteína FX que es al menos un 9 % idéntica a la SEC ID N° 1 y que comprende una serina en la posición 289, y donde no más del 1 % de la glicoproteína está fucosilada cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 °C en ausencia de una fuente de fucosa externa.

2. La célula de la reivindicación 1, donde el gen de FX comprende además una modificación que codifica una proteína FX que tiene un aminoácido en una posición específica seleccionada del grupo que consiste en una serina en la posición 79, una lisina en la posición 9, una leucina en la posición 136, una arginina en la posición 211 y una combinación de los mismos.

3. La célula de la reivindicación 1, donde:

(a) la proteína FX es al menos un 95 % idéntica a la SEC ID N° 1 y comprenden una serina en la posición 289;

(b) la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO); o

(c) la proteína FX es una proteína de hámster, ratón, rata, mono o ser humano.

4. La célula de la reivindicación 1, donde la célula expresa una glicoproteína que comprende una región CH2 de ¡nmunoglobulina y una región CH3 de ¡nmunoglobulina.

5. La célula de la reivindicación 4, donde la glicoproteína es un anticuerpo.

6. La célula de la reivindicación 4, donde la no más del 6 % de la glicoproteína está fucosilado cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 °C en ausencia de una fuente externa de fucosa.

7. La célula de la reivindicación 6, donde la no más del 2 % de la glicoproteína está fucosilado cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 °C en ausencia de una fuente externa de fucosa.

8. La célula de la reivindicación 1, donde la célula fucosila:

(a) al menos un 7 % de la glicoproteína cuando la célula se cultiva a una temperatura de 34 °C en ausencia de una fuente externa de fucosa; o

(b) al menos un 9 % de la glicoproteína cuando la célula se cultiva a una temperatura de 34 °C en ausencia de una fuente externa de fucosa.

9. La célula de la reivindicación 1, donde la célula fucosila:

(a) al menos un 7 % de la glicoproteína cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 °C en presencia de una fuente externa de fucosa; o

(b) al menos un 9 % de la glicoproteína cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 °C en presencia de una fuente externa de fucosa.

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína FX, donde la proteína FX comprende una serina en la posición 289 y donde la proteína FX es al menos un 9 % idéntica a la SEC ID N° 1.

11. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, donde:

(a) la proteína FX codificada por la secuencia de nucleótidos que comprende además una serina en la posición 79 o una lisina en la posición 9 o una leucina en la posición 136 o una arginina en la posición 211 o una combinación de los mismos; o

(b) la proteína FX codificada por la secuencia de nucleótidos es al menos un 95 % idéntica a la SEC ID N° 1.

12. La célula de la reivindicación 1, que además comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un gen de ¡nmunoglobulina.

13. Un método para producir una glicoproteína con fucosilación reducida, que comprende:

cultivar una célula de mamífero que comprende un gen de FC que codifica una proteína FX con una serina en la posición 289 y donde la proteína FX es al menos un 9 % idéntica a la SEC ID N° 1, a una temperatura de 37 °C y en ausencia de una fuente de fucosa externa, donde la célula expresa una glicoproteína que comprende una región CH2 de ¡nmunoglobulina y una región CH3 de ¡nmunoglobulina, y asilar la glicoproteína del cultivo.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el gen de FX codifica una proteína FX que tiene un aminoácido en una posición específica seleccionada de una serina en la posición 79, una lisina en la posición 9,

una leucina en la posición 136, una arginina en la posición 211 y una combinación de los mismos.

15. El método de la reivindicación 13, SEC ID N° la glicoproteína es un anticuerpo.


 

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