Cebadores para detectar Plasmodium.

Procedimiento para detectar o identificar una infección con más de una de entre Plasmodium falciparum,

Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale en una muestra; comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas (a) a (c):

a) extraer ADN de la muestra;

b) amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium haciendo reaccionar el ADN extraído en la etapa (a) en una mezcla de reacción que contiene una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra y un conjunto de cebadores específicos de secuencia; y

c) detectar o identificar la presencia o ausencia de un producto amplificado de más de una de entre Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale, amplificado en la etapa (b), siendo el conjunto de cebadores específicos de secuencia más de uno de entre:

un conjunto de cebadores que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 7 a 12 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium falciparum,

un conjunto de cebadores que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 13 a 18, SEC ID nº: 31 a 36 o SEC ID nº: 37 a 42 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium vivax,

un conjunto de cebadores que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 19 a 24 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium malariae, y

un conjunto de cebadores que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 25 a 30 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium ovale.

Cebadores para detectar Plasmodium.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores que puede detectar/identificar de manera exacta y rápida parásitos de malaria de una o más especies de Plasmodium en zonas endémicas de malaria, a un procedimiento para detectar e identificar los mismos y a un kit de detección de los mismos.

Antecedentes de la técnica

En muchos países en los que son endémicos parásitos de la malaria, el diagnóstico rápido y exacto de parásitos de la malaria presenta desafíos. De las cuatro especies de Plasmodium, P. falciparum, que puede ser mortal, debe identificarse inmediatamente y distinguirse de las otras especies de Plasmodium que producen la enfermedad en seres humanos (Moody, A., Clin. Microbiol. Rev. 15 (2002): 66-78).

Además, en la mayoría de las zonas endémicas de malaria aparecen infecciones que implican dos o más de estas especies; estas infecciones mixtas a menudo discurren sin reconocerse o subestimadas (Zimmerman, P.A., et al., Trends Parasitol. 20 (2004): 440-447). No poder detectar una infección mixta podría dar como resultado un tratamiento inadecuado, y puede dar como resultado una enfermedad grave (Mayxay, M., et al., Trends Parasitol. 20 (2004): 233-240). Hay, por tanto, una urgente necesidad de desarrollar procedimientos de diagnóstico de la malaria que puedan funcionar en zonas endémicas de manera fácil, rápida, altamente sensible y específica de especie.

Actualmente, el procedimiento de diagnóstico fácil para la malaria es el examen microscópico de frotis de sangre. Dada una alta densidad de parásitos, tal microscopía presenta una sensibilidad y especificidad relativamente altas y proporciona una determinación de la especie y del estadio de desarrollo. Sin embargo, en zonas endémicas en las que la densidad de parásitos es generalmente baja, este procedimiento es laborioso, requiere expertos bien entrenados y puede dar como resultado que se retrase la terapia.

Para mejorar la velocidad y precisión del diagnóstico de la malaria en regiones en las que no está disponible el diagnóstico de laboratorio convencional, los investigadores han desarrollado pruebas de diagnóstico rápidas (RDT) para la malaria basadas en inmunorreacción (Moody, A. Clin. Microbiol. Rev. 15 (2002): 66-78; Ndao, M., et al., J. Clin. Microbiol. 42 (2004): 2694-2700). Sin embargo, la sensibilidad varía entre productos (Murray, C. K., et al., Trop. Med. Int. Health. 8 (2003): 876-883), y sólo está disponible un producto específico de especie para P. falciparum. Se requieren tiempos de observación muy largos y considerable experiencia para el diagnóstico correcto mediante microscopía en varias circunstancias: cuando la parasitemia es baja, durante una infección mixta, tras tratamiento farmacológico y durante la fase crónica de la infección. Por tanto, esta situación puede conducir a resultados falsos negativos o a un diagnóstico de especie no fiable (Coleman, R., et al., Thailand. Malar. J. 14 (2006): 121).

Posteriormente, se desarrollaron procedimientos de biología molecular basados en amplificación del ADN, tales como PCR anidada y PCR cuantitativa en tiempo real, para el diagnóstico de la malaria. En comparación con la microscopía, estos procedimientos han demostrado superior sensibilidad y mayor especificidad para infecciones mixtas (Kimura, K., et al., Parasitol. Int. 46 (1997): 91-95; Perandin, F., et al., J. Clin. Microbiol. 42 (2004): 1214- 1219; Rougemont, M., et al., J. Clin. Microbiol. 42 (2004): 5636-5643; Singh, B., et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 60 (1999): 687-692; Singh, B., et al., Lancet. 363 (2004): 1017-1024; Snounou, G., et al., Mol. Biochem. Parasitol. 58 (1993): 283-292; Snounou, G., et al., Mol. Biochem. Parasitol. 61 (1993): 315-320). Sin embargo, el largo tiempo de respuesta, alto coste y disponibilidad sólo en laboratorios bien equipados hacen que esta tecnología de PCR sea inadecuada para el diagnóstico rutinario en laboratorios hospitalarios y en clínicas in situ de zonas endémicas (Hanscheid, T., y Grobusch, M. P., Trends Parasitol. 18 (2002): 395-398).

Con respecto a la detección de la malaria, los ejemplos 8 y 10 en el documento de patente 1 dan a conocer un procedimiento de extracción de ácidos nucleicos de muestras de sangre y de realización de PCR anidada para detectar cuatro especies de Plasmodium. El ejemplo 8 da a conocer cada secuencia de cebador directo y cebador inverso, que son diferentes de las secuencias de cebadores de la presente invención (documento de patente 1).

La publicación de patente de los documentos de patente 2 y 4 da a conocer procedimientos para detectar una o múltiples especies de infección por malaria basándose en un procedimiento de fase sólida o PCR anidada, en el que se utilizan uno o una pluralidad de múltiples tipos de cebadores para detectar clínicamente P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale. Sin embargo, esos cebadores presentan secuencias de cebadores diferentes a los de la presente invención.

La publicación de patente de los documentos de patente 3 da a conocer un procedimiento para detectar P. falciparum y/o P. vivax, en el que se unen cebadores específicos para P. falciparum y/o P. vivax a un marcador o soportes sólidos. Sin embargo, estas secuencias de cebadores específicos son diferentes de las secuencias oligonucleotídicas de los conjuntos de cebadores de la presente invención.

Se hace referencia asimismo al documento no de patente de la técnica anterior Rubio J.M. et al; Am. J. Trop. Med. Hyg. 60 (1999): 183-187.

Recientemente, se desarrolló una técnica novedosa, fácil y altamente sensible denominada amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) (Notomi, T., et al., Nucleic Acids Res. 28 (2000): e63; documento WO 2000/28082).

LAMP es un procedimiento de amplificación de ácido nucleico que se basa en la síntesis de ADN por desplazamiento de hebra de ciclo automático realizada mediante la ADN polimerasa Bst. Los productos amplificados son estructuras detallo-bucle con varias secuencias repetidas de la diana, y presentan múltiples bucles.

El principal mérito de este procedimiento es que no se requiere desnaturalización del molde de ADN (Nagamine, K., et al., Clin. Chem. 47 (2001): 1742-1743), y por tanto la reacción de LAMP puede realizarse en condiciones isotérmicas (que oscilan entre 60 y 65°C). LAMP requiere sólo una enzima y cuatro tipos de cebadores que reconocen seis regiones diana distintas. El procedimiento produce una gran cantidad de producto amplificado, dando como resultado una detección más fácil, tal como detección mediante juicio visual de la turbidez o fluorescencia de la mezcla de reacción (Mori, Y., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (2001): 150-154). Se conocen LAMP en las que se utiliza una sustancia fluorescente tal como fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), X- rodamina (ROX) o similar para medir los valores de polarización de fluorescencia de la mezcla de reacción, y LAMP en las que se utiliza SYBR Green 2, un colorante verde, como intercalador (publicación de patente japonesa no examinada n.° 2002-272475 y documento WO 2002/103053).

Varios investigadores han notificado procedimientos de LAMP para la identificación rápida de Plasmodium, Trypanosoma, Babesia, Fusarium, Listería y Legionella, y han recomendado la utilidad del ensayo de LAMP (Ikadai, H., et al., J. Clin. Microbiol. 42 (2004): 2465-2469; Kuboki, N., et al., J. Clin. Microbiol. 41 (2003): 5517-5524; Thekisoe, O., et al., Mol. Biochem. Parasitol. 122 (2002): 223-236; publicación de patente japonesa no examinada n.° 2005-245257, publicación de patente japonesa no examinada n.° 2007-61061, publicación de patente japonesa no examinada n.° 2003-219878 y Poon, L., et al., Clin. Chem. 52 (2006): 303-306).

Poon et al. estimaron que el coste de realizar un ensayo de LAMP es aproximadamente una décima parte de la PCR normal para la detección de P. falciparum (Poon, L., et al., Clin. Chem. 52 (20 06): 303-306). La mayor reducción en coste y tiempo proviene de una preparación de muestras sencilla sin extracción previa del ADN (Iwasaki, M., et al., Genome Lett. 2 (2003): 119-126).

Para la preparación de las muestras, era suficiente simplemente calentar la sangre infectada a 99°C durante 10 minutos para preparar un molde de ADN para LAMP (Poon, L., et al., Clin. Chem. 52 (2006): 303-306). Sin embargo, hasta la fecha, sólo se ha validado LAMP para la detección de parásitos de la malaria en diagnóstico clínico en pacientes con P. falciparum agudos (Poon, L., et al., Clin. Chem. 52 (2006): 303-306). Aunque P. falciparum es la causa más importante de enfermedad grave, su distribución geográfica se solapa con la de la infección por P. vivax, P. malariae... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para detectar o identificar una infección con más de una de entre Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale en una muestra; comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas (a) a (c):

a) extraer ADN de la muestra;

b) amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium haciendo reaccionar el ADN extraído en la etapa (a) en una mezcla de reacción que contiene una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra y un conjunto de cebadores específicos de secuencia; y

c) detectar o identificar la presencia o ausencia de un producto amplificado de más de una de entre Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale, amplificado en la etapa (b), siendo el conjunto de cebadores específicos de secuencia más de uno de entre:

un conjunto de cebadores que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID n°: 7 a 12 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium falciparum,

un conjunto de cebadores que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID n°: 13 a 18, SEC ID n°: 31 a 36 o SEC ID n°: 37 a 42 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium vivax,

un conjunto de cebadores que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID n°: 19 a 24 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium malariae, y

un conjunto de cebadores que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID n°: 25 a 30 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium ovale.

2. Procedimiento de detección o identificación según la reivindicación 1, en el que la extracción del ADN de la muestra se lleva a cabo sometiendo a ebullición la muestra que contiene el ADN, y realizando una centrifugación.

3. Procedimiento de detección o identificación según la reivindicación 2, en el que el tiempo de ebullición es de vahos minutos a diez y varios minutos.

4. Procedimiento de detección o identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que, en la etapa

(b) de amplificación de una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium, la reacción de amplificación del ADN se realiza a aproximadamente 60°C durante aproximadamente 1 hora utilizando un baño de agua a temperatura constante o un amplificador especialmente diseñado para LAMP.

5. Procedimiento de detección o identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que, en la etapa

(c) , se detecta o se identifica la presencia o ausencia de un producto de amplificación de más de una de entre Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale utilizando observación visual o un turbidímetro en tiempo real.

6. Procedimiento de detección o identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se realiza en una zona endémica de malaria.

7. Procedimiento de detección o identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se detectan o se identifican infecciones con más de una de entre Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale simultáneamente.

8. Kit de detección para más de una de entre P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale', que comprende más de uno de un conjunto de cebadores seleccionado de entre los conjuntos de cebadores definidos en la reivindicación 1, una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra, dNTP y un tampón de reacción.

9. Kit de detección según la reivindicación 8, en el que el kit de detección detecta más de una de entre P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale.