CARGA DE LIPOSOMAS CON IONES METALICOS.

Una composición liposómica que comprende liposomas que contienen una solución interna,

comprendiendo la solución interna iones cobre y uno o más agentes terapéuticos encapsulados, agente que es un fármaco o un agent5 e antineoplástico; y en la que: (a) los liposomas no comprenden un ionóforo; (b) dicho agente terapéutico se ha cargado en liposomas preformados que contienen dichos iones cobre en dicha 10 solución interna; (c) la solución interna comprende una solución compatible con iones cobre; y (d) la composición comprende los liposomas en una solución externa a los liposomas

Campo Técnico

Antecedentes de la Invención

Los liposomas son partículas microscópicas que están constituidas por una o más bicapas lipídicas que encierran un compartimento interno. Los liposomas pueden clasificarse en vesículas multilamelares, liposomas multivesiculares, vesículas unilamelares y liposomas gigantes. Los liposomas multilamelares (también conocidos como vesículas multilamelares o “MLV” (por sus siglas en inglés)) contienen múltiples bicapas concéntricas dentro de cada partícula liposómica, que se asemejan a las “capas de la cebolla”. Los liposomas multivesiculares consisten en membranas lipídicas que encierran múltiples cámaras acuosas no concéntricas. Los liposomas que encierran un solo compartimento acuoso interno incluyen vesículas unilamelares pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés) y vesículas unilamelares grandes (LUV, por sus siglas en inglés). Las LUV y las SUV varían en tamaño de aproximadamente 50 a 500 nm y 20 a 50 nm, respectivamente. Los liposomas gigantes típicamente varían en tamaño de 5000 nm a 50.000 nm y se usan principalmente para estudiar las características mecanoquímicas e interactivas de vesículas de bicapa lipídica in vitro (Needham et ál., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces (2000) 18: 183195).

Los liposomas se han estudiado y usado ampliamente como vehículos para una variedad de agentes tales como fármacos, cosméticos, reactivos diagnósticos y material genético. Puesto que los liposomas consisten en lípidos atóxicos, generalmente tienen baja toxicidad y por lo tanto son útiles en una variedad de aplicaciones farmacéuticas. En particular, los liposomas son útiles para incrementar la vida en circulación de agentes que tienen una semivida corta en la corriente sanguínea. Los fármacos encapsulados en liposomas tienen a menudo biodistribuciones y toxicidades que difieren mucho de las de los fármacos libres. Para el aporte in vivo específico, los tamaños, las cargas eléctricas y las

propiedades superficiales de estos vehículos pueden cambiarse

rápidamente al disminuir la longitud de la cadena de acilo de un lípido que constituye el vehículo.

Liposomas que contienen iones metálicos encapsulados en el interior de la vesícula se han usado en aplicaciones diagnósticas. Por ejemplo, se han usado liposomas para el aporte de agentes de contraste con el objetivo de acumular un agente de contraste en una zona deseada dentro del cuerpo de un sujeto. En la última aplicación, los liposomas se han usado principalmente para el aporte de radionucleótidos e iones metálicos paramagnéticos diagnósticos en obtención de imágenes gamma y por resonancia magnética, respectivamente. Esto incluye la encapsulación liposomal de radionucleótidos tales como 111In, 99mTc y 67Ga e iones paramagnéticos tales como Gd, Mn y óxido de manganeso. Típicamente, se emplean dos métodos para preparar liposomas con propósitos de obtención de imágenes. En el primer método, el metal se convierte en un quelato soluble y a continuación se introduce en el interior acuoso de un liposoma. En el segundo método, un agente quelante derivado con un grupo lipófilo se ancla a la superficie del liposoma durante o después de la preparación del liposoma.

Iones manganeso y de metales que no son de transición también han estado implicados en métodos para la encapsulación de agentes ionizables en liposomas que contienen un ionóforo insertado en la membrana del liposoma (véanse la patente de EE. UU. Nº 5837282 y Fenske et ál., Biochim. Biophys. Acta (1998) 1414: 188-204). En este método, el ionóforo trasloca el ion metálico a través de la membrana del liposoma en un intercambio por protones, estableciendo así un gradiente de pH. El establecimiento de un gradiente de pH apropiado a través de la bicapa del liposoma permite que el agente ionizable se encapsule, ya que el agente puede cruzar fácilmente la bicapa liposomal en forma neutra y subsiguientemente queda encapsulado y atrapado dentro del

interior acuoso del liposoma debido a la conversión en la forma cargada eléctricamente (véanse Mayer et ál., Patentes de EE. UU. 6083530, 5616341, 5795589 y 5744158; Mayer et ál., Biochimica et Biophysica Acta (1986) 857:123). Este trabajo surge de estudios mecánicos completados por Deamer et ál. (Biochimica et Biophysica Acta (1476) 455:269-271) que demostraron que los liposomas concentraban eficazmente varias

ambiente exterior de básico a neutro permite que agentes que están principalmente en forma neutra a pH de neutro a básico y principalmente en forma cargada eléctricamente a pH ácido sean atrapados fácilmente dentro de un liposoma. Fármacos que contienen restos ionizables, tales como grupos amina, son fácilmente encapsulados y retenidos en liposomas que contienen un interior ácido. Este método, en el que se usa un ionóforo (A23187) para generar un gradiente de pH a través de un liposoma que contiene manganeso, se ha usado para cargar topotecán en liposomas libres de colesterol que comprenden un conjugado PEG-lípido insertado en la membrana (véase el documento WO/0185131). Sin embargo, la carga y la retención satisfactorias usando un gradiente de pH de transmembrana se consigue aunque se mantenga el pH interno del liposoma. Puesto que el gradiente de pH sólo puede mantenerse durante cortos períodos de tiempo, la formulación clínica de fármacos en liposomas requiere la generación de un gradiente de pH en los liposomas justo antes de la carga del fármaco. Una segunda desventaja de este método resulta de la inestabilidad del lípido, y algunos fármacos, a pH ácido, que impide la necesidad del almacenamiento a largo plazo del liposoma cargado con fármaco. La congelación de formulaciones liposomales frena la velocidad de hidrólisis pero las formulaciones liposomales convencionales a menudo agregan y pierden componentes durante la descongelación a no ser que se usen crioprotectores apropiadamente seleccionados.

Se han presentado complejos entre fármacos tales como doxorrubicina o ciprofloxacina e iones metálicos divalentes

tales como Mn2+ (Bouma, J., et ál. (1986) Pharm. Weekbl. Sci. Edn. 16:109-133; Riley, C.M., et ál. (1993) J. Pharm. Biomed. Anal. 11:49-59; y Fenske, D.B. (1998) Biochim. Biophys. Acta. 1414:188-204). Recientemente, se presentó que la captación de doxorrubicina (pero no ciprofloxacina) dentro de LUV de esfingomielina/colesterol podría llevarse a cabo con manganeso en el medio interno de carga sin la presencia de un ionóforo (Cheung et ál., Biochimica et Biophysica Acta (1998) 1414:205). Se sugirió que un procedimiento que implicaba tanto la formación de complejo entre doxorrubicina e iones manganeso como la protonación de doxorrubicina dentro del liposoma daba como resultado la captación de este fármaco particular en presencia de iones manganeso. Se presentó el atrapamiento estable de doxorrubicina, pero este trabajo se basaba en el uso de liposomas de esfingomielina/colesterol, una formulación señalada para la retención óptima de fármaco. La metodología presentada por Cheung, et ál., que implicaba el uso de MnSO4 en tampón de HEPES de pH 7,4, no es reproducible debido a que el metal precipita en tal tampón.

Diversos grupos han investigado la interacción de iones metálicos con liposomas con el objetivo de evaluar los efectos de cationes metálicos sobre membranas de vesículas (Steffan et ál. (1994) Chem. Phys. Lipids 74(2): 141-150).

Ca2+

Cationes metálicos divalentes tales como se han relacionado con la formación desfavorable de reticulación inducida por metales de liposomas que contienen fosfatidilglicerol (PG) debido a la carga eléctrica negativa de la superficie del liposoma. Los iones metálicos también se han relacionado con el incremento de la temperatura de transición de fase de sistemas membranosos modelados negativamente (Borle, et ál., (1985) Chemistry and Physics of Lipids 36: 263-283; Jacobson, et ál., (1975) Biochemistry 14(l):152-161). Estos estudios revelaban que la adición de calcio a membranas de dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) daba como resultado un incremento de la temperatura de transición de...

l. Una composición liposómica que comprende liposomas que contienen una solución interna, comprendiendo la solución interna iones cobre y uno o más agentes terapéuticos encapsulados, agente que es un fármaco o un agente antineoplástico; y en la que:

(a) los liposomas no comprenden un ionóforo;

(b) dicho agente terapéutico se ha cargado en liposomas preformados que contienen dichos iones cobre en dicha solución interna;

(c) la solución interna comprende una solución compatible con iones cobre; y

(d) la composición comprende los liposomas en una solución externa a los liposomas.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho agente terapéutico es una quinolona, una antraciclina, un antibiótico, una mostaza nitrogenada, una camptotecina o una podofilotoxina.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que la solución externa y las superficies externas de los liposomas no contienen sustancialmente iones metálicos no complejados.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la solución externa comprende un agente quelante de metales.

5. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la solución externa y la solución interna tienen sustancialmente el mismo pH en el intervalo de 6,0-8,5.

6. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que los liposomas contienen menos de 20% de colesterol.

7. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que los liposomas comprenden uno

o más lípidos que tienen carga eléctrica negativa a pH fisiológico.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el uno o más lípidos con carga eléctrica negativa se

seleccionan de fosfatidilglicerol (PG) y fosfatidilinositol (PI).

9. Un método para cargar un agente terapéutico en un liposoma en una composición liposómica, comprendiendo el método:

i) proporcionar una composición liposómica que comprende un liposoma en una solución externa, conteniendo el liposoma una solución interna que comprende iones cobre encapsulados; ii) añadir uno o más agentes terapéuticos a la solución externa; y iii) mantener el agente en la solución externa durante un tiempo suficiente para cargar el agente en el liposoma, en el que los liposomas no contienen un ionóforo, y la solución interna comprende una solución compatible con iones cobre.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la solución externa y las superficies externas del liposoma no contienen iones metálicos no complejados; y/o

los iones metálicos no complejados se retiran de la solución externa antes de la etapa (ii) mediante cromatografía o mediante intercambio de solución intensivo o diálisis; y/o

la solución interna y la solución externa tienen sustancialmente el mismo pH; y/o los liposomas contienen menos de 20% en moles de colesterol.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la solución externa comprende un agente quelante de metales.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que los liposomas comprenden uno o más lípidos que tienen carga eléctrica negativa a pH fisiológico.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el uno o más lípidos con carga eléctrica negativa se seleccionan de PG y PI.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en el que un segundo agente terapéutico se carga por medio de un gradiente de pH de transmembrana formado después de la etapa (iii).

15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en el que un segundo agente terapéutico se carga por medio de un gradiente de transmembrana establecido con un ionóforo presentado en el liposoma, en el que el gradiente de transmembrana se establece después de la etapa (iii).

16. Una composición liposómica que comprende liposomas que comprenden uno o más agentes terapéuticos producidos mediante el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-15.

17. Un método para seleccionar una composición liposómica que tiene una propiedad de carga o retención preferida para un agente, que comprende:

(a) proporcionar una primera composición liposómica que comprende un liposoma en una solución externa, conteniendo el liposoma una solución interna que comprende uno o más iones de metales de transición;

(b) añadir el agente a la solución externa de la composición de (a) durante un período de tiempo para cargar el agente en el liposoma de la primera composición;

(c) proporcionar una segunda composición liposómica que comprende un liposoma en una solución externa, conteniendo el liposoma una solución interna que comprende uno o más iones de metales de transición;

(d) añadir el agente a la solución externa de la composición de (c) durante un período de tiempo para cargar el agente en el liposoma de la segunda composición;

(c) comparar la cantidad de agente cargado o la cantidad de agente retenido a lo largo del tiempo, para el liposoma de la composición resultante en (b) con el liposoma de la composición resultante en (d); y

(f) seleccionar la composición liposómica resultante en

(b) o (d) que tenga una mayor cantidad de agente cargado

o retenido; en el que:

(I) las composiciones liposómicas de (a) y (c) difieren en uno o más de: (i) los iones metálicos presentes en la solución interna; (ii) los lípidos en el liposoma de la composición liposómica; y (iii) la concentración de iones metálicos presente en la solución interna;

(II) el período de tiempo en (b) es diferente del período de tiempo en (d); o

(III) la carga en (b) se realiza a una temperatura diferente que la carga en (d).

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que una de las composiciones primera y segunda comprende liposomas que contienen colesterol y la otra de dichas composiciones comprende liposomas de bajo contenido de colesterol.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, en el que al menos una de las composiciones primera y segunda comprende uno o más iones metálicos seleccionados de Cu, Co y Zn.

20. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en el que la solución interna de cada una de las composiciones primera y segunda comprende una solución compatible con metal.

21. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17-20, que comprende la etapa adicional de cargar un agente en liposomas de la composición que se observa que tiene la mayor cantidad de agente cargado o retenido.