Bioensayo de toxicidad ambiental basado en ficobiontes aislados de líquenes.

Bioensayo de toxicidad ambiental basado en ficobiontes aislados de líquenes.

En la presente invención se contempla un método para evaluar la toxicidad de una muestra basado en a) la obtención de una población de ficobiontes en un medio de cultivo estéril adecuado para cada tipo de ensayo; b) la preparación de una suspensión con la población de ficobiontes obtenida en a) en un medio de cultivo adecuado; c) la exposición de la suspensión obtenida en b) a la muestra esterilizada cuya toxicidad se quiere evaluar, d) la incubación de la suspensión de ficobiontes aislados de líquenes (c) en condiciones de temperatura entre 5 y 25ºC, y un fotoperiodo de 8 a 12 h de luz y 8 a 12 h de oscuridad de intensidad de luz blanca entre 5-200 μmolm-2s-1 durante un periodo adecuado (entre 0 y 100 horas), según la muestra a); e) medición de la dispersión óptica del cultivo obtenido en la etapa d); f) cuantificación del DNA de la muestra obtenida en d); g) determinación de la autofluorescencia de la clorofila de la muestra obtenida en la etapa d).

BIOENSAYO DE TOXICIDAD AMBIENTAL BASADO EN FICOBIONTES AISLADOS DE LíQUENES

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a materiales y métodos para evaluar la toxicidad ambiental de aguas, efluentes, suelos, lixiviados e incluso emisiones gaseosas, estando la invención dentro del sector de la biotecnología, bioquímica, fisiología celular, medio ambiente y

ecotoxicología. Concretamente se refiere a bioensayos de toxicidad ambiental realizados en ficobiontes aislados de líquenes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

La toxicología ambiental estudia el impacto de los contaminantes sobre la estructura y función de los sistemas biológicos. Se trata de una relativamente reciente disciplina que se apoya en los conocimientos que proporcionan diferentes ramas del conocimiento como la Ecología, la Química Orgánica, la Biología Molecular o la Microbiología.

Una herramienta extremadamente útil que emplea la toxicología ambiental son los bioensayos. Un bioensayo puede definirse como un experimento en el que se determina la actividad biológica de una sustancia mediante la observación de su efecto sobre organismos intactos, órganos o diferentes preparaciones biológicas. Este tipo de ensayos proporcionan la posibilidad de evaluar la toxicidad de una muestra sin conocer la completa composición química de la misma. Las muestras contaminadas que encontramos en el medio ambiente pueden presentar una toxicidad debida, no tanto a un único compuesto puro, como a una compleja matriz. Esto va a dar lugar a una serie de interacciones entre estas sustancias, lo que puede provocar diferentes efectos:

Efecto aditivo: el efecto combinado de dos sustancias es igual al efecto provocado por cada una de ellas por separado.

Efecto sinérgico: el efecto de la combinación de las dos sustancias es mucho mayor que el causado por cada una de ellas por separado.

Potenciación: se da cuando una sustancia que no es tóxica incrementa el efecto tóxico de otra sustancia que sí lo es.

Antagonismo: ocurre cuando dos sustancias se contrarrestan o cuando una de ellas 5 interfiere en la acción de la otra.

Debido a estas posibles interacciones, el análisis de la cantidad y composición de los contaminantes de una muestra no es suficiente para dar una completa información sobre los efectos biológicos que puede provocar. Sin embargo, los bioensayos sí pueden 10 proporcionarnos esa información (S.A. Mansour, M.F. Gad , Risk assessment of pesticides and heavy metal contaminants in vegetables: a novel bioassay method using Daphnia magna Slraus. Food and Chemical Toxicology, 2010, 48: 377-389; K. Wadhia, K.C. Thompson, Low-cost ecotoxicity testing of environmental samples using microbiotest for potential implementation of the Water Framework Directive. Trends in Analytical Chemistr y ,

2007, 26: 300-307) .

Existe una amplia variedad de bioensayos de toxicidad que utilizan diferentes especies, que van desde las bacterias hasta las aves. La especie elegida para la realización de un bioensayo debe cumplir una serie de criterios como por ejemplo la posibilidad de estar 20 disponible en cantidad suficiente, ya sea gracias a cultivo en laboratorio, en criadero o por recolección en el campo. También es importante que soporte bien las condiciones de laboratorio y que permita obtener una población homogénea (K. Wadhia, K.C. Thompson,

Low-cost ecotoxicity testing of environmental samples using microbiotest for potential implementation of the Water Framework Directive. Trends in Analytical Chemistr y , 2007, 26: 25 300-307) .

La mayoría de los bioensayos están basados en la evaluación de la mortalidad que provoca la muestra tóxica en el organismo elegido para el bioensayo. Algunos ejemplos de organismos usados en bioensayos son:

Dafnias: Daphnia magna, D. pulex, D. pulicaria. Estos organismos son muy utilizados para bioensayos de toxicidad en muestras de agua. En este caso la toxicidad se evalúa contando al microscopio los individuos que mueren tras entrar en contacto con la muestra contaminada.

Bacterias: Vibrio fisheri.

Se trata de una bacteria marina utilizada tanto para muestras de agua como para lixiviados de suelo. El bioensayo se basa en la bioluminiscencia que emite la bacteria. Esa bioluminiscencia se ve afectada de manera directamente proporcional

a la presencia de tóxicos, de forma que se evalúa la toxicidad de la muestra midiendo con técnicas espectrofotométricas la disminución de luminiscencia.

Lumbricidos: Eisenia foeUda . Muy utilizado en estudios de impacto ambiental de pesticidas, herbicidas, metales 10 pesados y PAHs en suelos. La toxicidad se relaciona con el número de individuos que mueren.

Algas unicelulares: Chlamydomonas reinhardi, Selenastrum capricornutum. Estos organismos se emplean en bioensayos con muestras de agua. En este caso se 15 evalúa la toxicidad de las muestras observando el crecimiento de las algas.

Peces: Oncorhynchus mykiss (trucha arco iris) , Salvenilus fontinalis (trucha de arroyo) , Carassius auratus (carpa dorada) .

La muerte de los individuos como criterio de valoración de la toxicidad es por tanto de gran interés y muy utilizado en los bioensayos. Sin embargo, en ocasiones es dificil registrar los fallecimientos y deben realizarse recuentos de un elevado número de muestras, lo que hace que sea un trabajo arduo y lento. Además puede ocurrir que los contaminantes estén en 25 cantidades no letales o en formas poco biodisponibles haciendo improbable el fallecimiento inmediato (R Feito, Y. Valcárcel, M. Catalá, Biomarker assessment of toxicity with miniaturized bioassays: diclofenac as a case study, Ecotoxicology, 2012, 21 : 289-296; J. Rodríguez Pérez, S. Loureiro, S. Menezes, P. Palma, RR Frenandes, I.R. Barbosa, A.MV.M. Soares, Assessment of water quality in the Alqueva Reservoir (Portugal) using

bioassays, Environmental Science and Pollution Research, 2010, 17: 688-702) . Otro problema es el volumen de muestra ambiental, que en ocasiones, como en bioensayos con peces, es del orden de litros, lo que dificulta su almacenamiento, mantenimiento y manipulación.

Existe una manera de evaluar precozmente estos efectos tóxicos no letales, los biomarcadores. Los biomarcadores pueden definirse como cualquier parámetro biológico mesurable y cuantificable que sirve como indice para la evaluación del estado fisiológico o de la salud. Podemos afirmar que los biomarcadores son indicadores a corto plazo de efectos biológicos a largo plazo (M.P. Cajaraville, Science of the total environment, 2000, 247:295-311) .

Por lo tanto, un uso correcto de los biomarcadores tiene la capacidad potencial de anticipar cambios en niveles de organización más complejos como poblaciones, comunidades y ecosistemas y se pueden utilizar de manera predictiva, permitiendo la aplicación de medidas correctoras antes de que ocurra un daño ambiental irreversible. Entre los biomarcadores empleados se encuentran la dispersión óptica, la autofluorescencia de la clorofila y la cuantificación de DNA.

La medición de la dispersión óptica es un método de estimación indirecta de la replicación y crecimiento rápido y sencillo. Cuando un haz de luz golpea un cuerpo en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es dispersada, parte es absorbida y parte es transmitida. La turbidimetría es la técnica que mide la luz que se dispersa al golpear una partícula como un decrecimiento de la luz transmitida a través del medio. Así, este método consiste en medir la turbidez, debida a la dispersión de la luz, de un medio liquido con células en suspensión. La luz dispersada será mayor en cuanto la suspensión contenga más material celular, con lo que la muestra será más turbia. Esta turbidez se mide en unidades de absorbancia con un espectrofotómetro o fotocolorímetro. Debe tenerse en cuenta que mediante este método no se distinguen células vivas de células muertas. (A.M. Manacorda, D.P. Cuadros, A. Alvarez, Manual Práctico de Microbiología, Universidad Nacional del Comahue, 2007:51; M. K. Chung, R. Hu, M.H. Wong, K.C. Cheung. Comparative toxicity of hydrophobic contaminants /0 microalgae and higher plan/s. Ecotoxicology, 2007, 16: 393-402.) .

La autofluorescencia de la clorofila es un biomarcador que en las últimas décadas se ha convertido en un parámetro clave a la hora de realizar estudios con organismos de origen vegetal. Cualquier alteración producida en la cantidad o integridad de la molécula de clorofila puede afectar a los procesos fotosintéticos y, por lo tanto, al estado fisiológico de los organismos. Este método se basa el fenómeno de reemisión (en forma de fluorescencia) de la luz absorbida por parte de las moléculas de clorofila....

1. Método para evaluar la toxicidad de una muestra a partir de ficobiontes de líquenes que comprende:

a. obtención de una población de ficobiontes;

b. preparación de una suspensión con la población de ficobiontes obtenida en a) en un medio de cultivo adecuado,

c. exposición de la suspensión obtenida en b) a la muestra esterilizada cuya toxicidad se quiere evaluar;

d. incubación de la suspensión de ficobiontes de líquenes obtenida en c) en condiciones de temperatura entre 5 oC y 25 oC, fotoperiodo de 8 o 12 h de luz y 8 o 12 h de oscuridad de intensidad de luz blanca entre 5-200 Ilmol m-2s-1

durante un periodo adecuado (entre O y 100 horas) , según la muestra a analizar;

e. medición de la dispersión óptica de la muestra obtenida en d) ; y/o

f. cuantificación del DNA de la muestra obtenida en d) : y/o

g. determinación de la autofluorescencia de la clorofila de la muestra obtenida en d) .

h. Análisis de los datos obtenidos en e) a g) para evaluar la toxicidad de la muestra.

2. Método, según la reivindicación anterior, caracterizado porque la suspensión obtenida en la etapa d) se puede congelar a una temperatura máxima de -18º C.

3. Método, según las reivindicaciones anteriores, por el que se determina la cantidad de DNA de ficobiontes de líquenes, donde se utiliza una sonda específica de DNA y longitudes de onda de excitación y emisión adecuadas.

4. Método, según las reivindicaciones anteriores, por el que se mide la autofluorescencia de la clorofila de ficobiontes de líquenes donde se utiliza un filtro de excitación con una longitud de onda entre 450 nm y 500 nm y con un filtro de emisión con una longitud de onda entre 600 nm y 650 nm.

5. Método, según las reivindicaciones anteriores, por el que se mide la dispersión óptica de la suspensión de ficobiontes utilizando un equipo capaz de medir la absorban cia entre 550 y 700 nm .

6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el microensayo está basado en ficobiontes aislados del liquen Ramalina farinacea.

7. Método, según Gl:lalEjl:liem de las reivindicaciones 1 a 5, donde el microensayo está

basado en el ficobionte liquénico Asterochloris erici. 10

8. Empleo de la dispersión óptica en ficobiontes de líquenes como biomarcador en métodos para evaluar la toxicidad de una muestra.

9. Empleo de la cantidad de DNA en ficobiontes de líquenes como biomarcador en 15 métodos para evaluar la toxicidad de una muestra.

10. Empleo de la autofluorescencia de la clorofila en ficobiontes de líquenes como biomarcador en métodos para evaluar la toxicidad de una muestra.

. Kit para eva luar la toxicidad de una muestra utilizando las alteraciones en la actividad óptica y la autofluorescencia de la clorofila como biomarcadores, según el método descrito en las reivindicaciones anteriores, que comprende, como mínimo, un vial con una suspensión de ficobiontes en medio de cultivo, una botella con medio de cultivo estéril y un protocolo con instrucciones para realizar el bioensayo.

12. Kit para evaluar la toxicidad de una muestra utilizando la cantidad de DNA como biomarcador, según el método descrito en las reivindicaciones anteriores, que comprende, además del material descrito en la reivindicación 11, un vial con reactivo concentrado, tampón de dilución y un protocolo con instrucciones para realizar el

bioensayo y la cuantificación de DNA.