Biocatalizadores de transaminasa.

Un polipéptido de transaminasa capaz de convertir el sustrato de cetoamida 4 - oxo - 4 - [3 - (trifluorometil) - 5,

6 - dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 - α] pirazin - 7 (8H) - il] - 1 - (2, 4, 5 - trifluorofenil) butan - 2 - ona en elproducto (2R) - 4 - oxo - 5 4 - [3 - (trifluorometil) - 5, 6 - dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 - α] pirazin - 7 (8H) - il] - 1- (2, 4, 5 - trifluorofenil) butan - 2 - amina, en la que el polipéptido de transaminasa comprende una secuenciaaminoácida que es idéntica en, al menos, el 80 % a la SEC ID Nº 4 y en la que la secuencia aminoácida incluye,al menos, las siguientes características: (1) el residuo correspondiente a X223 de la SEC ID Nº es P; (2) elresiduo correspondiente a X69 de la SEC ID Nº 2 es G, C, T, A o S y / o el residuo correspondiente a X284 de laSEC ID Nº 2 es G; y (3) el residuo correspondiente a X122 de la SEC ID Nº 2 es M, I, V o H.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/025685.

Solicitante: Codexis, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 200 Penobscot Drive Redwood City, CA 94063 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: DEVINE, PAUL, N., SAVILE,CHRISTOPHER, MUNDORFF,EMILY, MOORE,JEFFREY C, JANEY,JACOB M.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/54 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Transferasas (2).
  • C12N9/10 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
  • C12P13/00 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno.

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Fragmento de la descripción:

Biocatalizadores de transaminasa

CAMPO TÉCNICO

La presente divulgación se refiere a biocatalizadores de transaminasa y a procedimientos de utilización de biocatalizadores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Tras la ingestión de un alimento, se liberan un grupo de hormonas denominadas incretinas, que incluyen glucagón como péptido – 1 (GLP – 1) y péptido insulinotrópico – dependiente de glucosa (GIP) . Las incretinas estimulan la liberación de insulina y reprimen la liberación de glucagón de manera dependiente, retrasa el vaciado gástrico y aumenta la saciedad. Las incretinas se degradan rápidamente por la Dipeptidil peptidasa IV (DPP – 4) .

La Sitagliptina forma parte de una clase de medicamentos anti hiperglicémicos que inhiben la DPP – 4. La actividad inhibitoria de la DPP – 4 y, por tanto, el retraso de la inactivación de creatinas parece mejorar la función insular incrementando la reactividad de las células alfa y beta a la glucosa, dando como resultado una secreción de glucosa – dependiente de insulina mejorada y una secreción reducida de glucagón inapropiado. Debido a sus efectos anti hiperglicémicos, la Sitagliptina ha sido aprobada para su uso en el tratamiento de diabetes Tipo 2 en numerosos países.

El proceso actual de fabricación de la Sitagliptina presenta hidrogenación asimétrica de una amida enamina desprotegida (patente US Nº 7.468.459, emitida el 23 de diciembre del 2008; Shultz et al., 2007, Acc. Chem. Res. 40 1320 – 1326) . El uso de un catalizador de rodio con ligando de tipo JOSIPHOS en metanol a 50 ºC y 250 psi presenta Sitaglipina como base libre en un 97 % e.e. La mejora de la cristalización de la base libre produce Sitagliptina con gt; 99, 5 % e.e. Y un 84 % de rendimiento, y la subsecuente reacción con ácido fosfórico da lugar a monohidrato fosfato de Sitaglipina, el principio farmacéutico activo (“API”) en JANUVIA®, en un 97 % del rendimiento completo a partir del sustrato de amida enamina.

Para más referencias sobre el enfoque de resolución química para sintetizar Sitagliptina véanse Dooseop et al., 2005 (Journal of medicinal chemistr y , 48: 141 – 151) , Edmonson et al., 2004 (Bioorganic & medicinal chemistr y ,

14: 5155 – 5155) y la patente WO 2004 / 085378.

En Oue, 1999, J. Biol. Chem, 274: 2344 – 2349, se trata el resideño de la especifidad del sustrato de una 35 enzima mediante efectos acumulativos de las mutaciones de residuos en sitio no activo.

Se aconsejan otras mejoras en el proceso de fabricación de Sitagliptina.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención presenta un polipéptido de transaminasa capaz de convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) –il] –1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina, en la que el polipéptido de transaminasa 45 comprende una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80 % a la SEC ID Nº 4 y en la que la secuencia aminoácida incluye, al menos, las siguientes características: (1) el residuo correspondiente a X223 de la SEC ID Nº es P; (2) el residuo correspondiente a X69 de la SEC ID Nº 2 es G, C, T, A o S y / o el residuo correspondiente a X284 de la SEC ID Nº 2 es G; y (3) el residuo correspondiente a X122 de la SEC ID Nº 2 es M, I, V o H.

La invención también presenta un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención.

La invención también presenta una célula huésped que comprende un vector de expresión que incluye un polinucleótido de la invención.

La invención también presenta un proceso de preparación de un compuesto cuya fórmula estructural (I) es:

que tiene la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *; con un exceso 65 enantiomérico de, al menos, el 70 % respecto al enantiómero opuesto, en el que Z es OR2 o NR2R3;

R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo; R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo heterocíclico membrado de 4– a 7– que contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, NH y NC1–4 alquilo, sustituyendo, o no, el anillo heterocíclico por

uno de los tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, C1–4 alcoxi y C1–4 alquilo, en el que alquilo y alcoxi son sustituidos, o no, por uno a cinco átomos de flúor; y fusionando el sistema del anillo heterocíclico a un sistema de anillos carbocíclicos aromáticos o saturados de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros que contiene de uno o dos heteroátomos seleccionados entre O, S y

NC0–4 alquilo, sustituyendo, o no, el sistema de anillos fusionados por uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, amino, flúor, C1–4 alquilo, C1–4 alcoxi y trifluorometil; el proceso incluye la etapa de poner en contacto una cetona proquiral de fórmula estructural (II) :

con un polipéptido de transaminasa de la invención en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas, en las que, opcionalmente:

i) R1 es un bencilo en el que el grupo fenil de bencil es sustituido, o no, por uno a 3 sustituyentes seleccionado del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; o 25 ii) Z es NR2R3, por ejemplo un heterociclo de fórmula estructural (III) :

en la que R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo, sustituido, o no, por uno a cinco átomos de flúor.

La invención también presenta una composición que comprende el polipéptido de transaminasa según la invención y:

(a) Un compuesto de fórmula estructural (I) : 40

que tiene la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *; en el que:

Z es OR2 o NR2R3; R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo; R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo heterocíclico membrado de 4– a 7– que contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, NH y NC1–4 alquilo, sustituyendo, o no, el anillo 55 heterocíclico por uno de los tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, C1–4 alcoxi y C1–4 alquilo, en el que alquilo y alcoxi son sustituidos, o no, por uno a cinco átomos de flúor; y fusionando el sistema del anillo heterocíclico a un sistema de anillos carbocíclicos aromáticos o saturados de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros que contiene 60 de uno o dos heteroátomos seleccionados entre O, S y NC0–4 alquilo, sustituyendo, o no, el sistema de anillos fusionados por uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, amino, flúor, C1–4 alquilo, C1–4 alcoxi y trifluorometil;

(b) Un compuesto de fórmula estructural (1) : 65

que tiene la configuración – (R) en el centro estereogénico marcado con ***, en el que:

Ar es un fenilo sustituido, o no, por uno a cinco sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; y R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo sustituido, o no por uno a cinco átomos de flúor;

(d) Un compuesto de fórmula estructural (II)

que tiene la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *, en el que:

Z es OR2 o NR2R3; R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo; R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un polipéptido de transaminasa capaz de convertir el sustrato de cetoamida 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1 – (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – ona en el producto (2R) – 4 – oxo – 4 – [3 – (trifluorometil) – 5, 6 – dihidro [1, 2, 4] triazol [4, 3 – α] pirazin – 7 (8H) – il] – 1

– (2, 4, 5 – trifluorofenil) butan – 2 – amina, en la que el polipéptido de transaminasa comprende una secuencia aminoácida que es idéntica en, al menos, el 80 % a la SEC ID Nº 4 y en la que la secuencia aminoácida incluye, al menos, las siguientes características: (1) el residuo correspondiente a X223 de la SEC ID Nº es P; (2) el residuo correspondiente a X69 de la SEC ID Nº 2 es G, C, T, A o S y / o el residuo correspondiente a X284 de la SEC ID Nº 2 es G; y (3) el residuo correspondiente a X122 de la SEC ID Nº 2 es M, I, V o H.

2. El polipéptido de transaminasa de la reivindicación 1 en la que el polipéptido de transaminasa es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto:

i) en condiciones de reacción definidas en presencia de una isopropilamina dadora del grupo amino a niveles de producto detectables por UV – HPLC a 210 nm en la que la condición de reacción comprende 2 g / L de sustrato de cetoamida, isopropilamina 0, 5 M, 22 ºC, pH 7, 5, 5 % de DMSO, 100 μM de fosfato de piridocal, 20 mg / mL de polipéptido de transaminasa y opcionalmente una actividad superior o igual a la actividad del polipéptido de la SEC ID Nº 4 en condiciones de reacción definidas;

ii) con al menos un 90 % de exceso enantiomárico; o iii) con al menos un 99 % de exceso enantiomárico.

3. El polipéptido de transaminasa de la reivindicación 1 en la que la secuencia de aminoácidos incluye las siguientes características:

i) X69 esG, C, T, A o S; X122 es M, I, V o H y X223 es P; ii) X122 es M, I, V o H; X223 es P y X284 es G; iii) X69 esG, C, T, A o S; X122 es M, I, V o H; X223 es Py X284 esG o; iv) X69 es Co T; X122 es M o I; X223 es P y X284 es G.

4. El polipéptido de transaminasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que la secuencia de aminoácidos comprende adicionalmente una diferencia residual comparada a la SEC ID Nº 2 en una o más de las siguientes posiciones residuales: X4; X5; X8; X18; X25; X26; X27; X28; X30; X41; X42; X48; X49; X50; X54; X55; X60; X61; X62; X65; X69; X81; X94; X96; X102; X117; X120; X122; X124; X126; X136; X137; X138; X146; X148; X150; X152; X155; X156; X160; X163; X164; X169; X174; X178; X195; X199; X204; X208; X209; X211; X215; X217; X223; X225; X230; X252; X269; X273; X282; X284; X292; X297; X302; X306; X321; y X329, opcionalmente en las que las diferencias residuales aminoácidos en las posiciones residuales se seleccionan de los siguientes:

X4 es Y; X5 es K; X8 es P; X18 es C o I; X25 es Q; X26 es H; X27 es C; X28 es P; X30 es Q o M; X41 es H o S; X42 es G; X48 es Q, D, V, G o A, X49 es T; X50 es L; X54 es P o H; X55 es V; X60 es F; X61 es Y; X62 es T, Y o F; X65 es A; X81 es G; X94 es I o L; X96 es L; X102 es L o K; X117 es G; X120 es Y; X124 es T, H o N;X126 es T; X136 es Y o F; X137 es T o I; X138 es K oP; X146 es R; X148 es A o F; X150 es F, H o S; X152 es G, I, L S o C; X155 es M, V o T; X156 es Q; X160 es L; X163 es H o V; X164 es V o P; X169 es L; X174 es A; X178 es S; X195 es F o Q; X199 es W o I; X204 es A; X208 es H, C, G, K, N, Y, D o S; X209 es L; X211 es I; X215 es C; X217 es N; X225 es Y; X230 es V; X252 es F; X269 es P; X237 es Y; X282 es S; X292 es T; X297 es S; X302 es A; X306 es L; X321 es Py X329 es H.

5. El polipéptido de transaminasa de la reivindicación 4 en el que la secuencia de transaminasa incluye adicionalmente al menos las siguientes características:

i) X26 es H, y/o X62 es T o F; X65 es A; X136 es Y o F; X199 esWo I; y X209 es L;

ii) X61 es Y; X62 es T o F; X65 es A; X94 es I o L; X136 es Y o F; X199 es W o I; X209 es L; X215 es C; y X282 es S;

iii) X8 es P; X61 es Y; X62 es T o F; X65 es A; X81 es G; X94 es I o L; X136 es Y o F; X199 es W o I; X209 es L; X215 es C; X217 es N; X269 es P; X282 es S; X297 es S; y X321 es P;

iv) X8 esP;X60 esF; X61 es Y; X62 es T o F; X65 es A; X81 es G; X94 es I o L; X96 es L; X124 es T, H o N; X136 es Y o F; X169 es L; X199 es W o I; X209 es L; X215 es C; X217 es N; X269 es P; X273 es Y; X282 es S; X297 es S; y X321 es P; o v) X8 esP; X60 es F; X61 es Y; X62 es T o F; X65 es A; X81 es G; X94 es I o L; X96 es L; X124 es T, H o N; X 126 es T; X136 es Y o F; X150 es F, H, o S; X152 es G, I, L, S o C; X169 es L; X199 es W o I; X209 es L; X215 es C; X217 es N; X269 es P; X273 es Y; X282 es S; X297 es S; y X321 es P.

6. El polipéptido de transaminasa de la reivindicación 1 en el que:

i) La secuencia de aminoácidos corresponde a la secuencia SECs ID Nº: 110, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76,

78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168;

ii) La transaminasa es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad, 50 a 100 o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 4, en la que opcionalmente la secuencia aminoácido corresponde a la secuencia de la SEC ID Nº: 110, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

iii) La transaminasa es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad, 1, 1 a 5

o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 22, en la que opcionalmente la secuencia aminoácida corresponde a la secuencia de la SEC ID Nº: 110, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

iv) La transaminasa es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad, 1, 1 a 5

o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 48, en la que opcionalmente la secuencia aminoácida corresponde a la secuencia de la SEC ID Nº: 110, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

v) La transaminasa es capaz de convertir el sustrato de cetoamida en el producto con una actividad, 1, 1 a 5

o más veces superior a la del polipéptido de la SEC ID Nº 58, en la que opcionalmente la secuencia aminoácida corresponde a la secuencia de la SEC ID Nº: 110, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 o 168.

7. Un polinucleótido que codifica a un polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 6 en el que opcionalmente el polinucleótido corresponde a la secuencia de SEC ID Nº 109: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, o 167.

8. Una células huésped que incluye un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la reivindicación 7, que comprende además una secuencia de control, en la que por ejemplo:

i) la secuencia de control comprende un activador o; ii) la secuencia de control comprende una señal de secreción, en la que la célula huésped es opcionalmente

E. coli.

9.

que tiene la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *; con un exceso enantiomérico de, al menos, el 70 % respecto al enantiómero opuesto, en el que Z es OR2 o NR2R3; R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo; R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo heterocíclico membrado de 4– a 7– que contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, NH y NC1–4 alquilo, sustituyendo, o no, el anillo heterocíclico por uno de los tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, C1–4 alcoxi y C1–4 alquilo, en el que alquilo y alcoxi son sustituidos, o no, por uno a cinco átomos de flúor; y fusionando el sistema del anillo heterocíclico a un sistema de anillos carbocíclicos aromáticos o saturados de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros que contiene de uno o dos heteroátomos seleccionados entre O, S y NC0–4 alquilo, sustituyendo, o no, el sistema de anillos fusionados por uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, amino, flúor, C1–4 alquilo, C1–4 alcoxi y trifluorometil; el proceso incluye la etapa de poner en contacto una cetona proquiral de fórmula estructural (II) :

con un polipéptido de transaminasa de la invención en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas, en las que, opcionalmente:

i) R1 es un bencilo en el que el grupo fenil de bencil es sustituido, o no, por uno a 3 sustituyentes seleccionado del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; o ii) Z es NR2R3, por ejemplo un heterociclo de fórmula estructural (III) :

en la que R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo, sustituido, o no, por uno a cinco átomos de flúor.

10. Un proceso según la reivindicación 9 de preparación de un compuesto de fórmula estructural (1) :

que tiene la configuración – (R) en el centro estereogénico marcado con ***, con un exceso enantiomérico de, al menos, el 70 % respecto al enantiómero que tiene la configuración – (S) opuesta, en la que: Ar es un fenilo sustituido, o no, por uno a cinco sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; y R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo sustituido, o no, por uno a cinco átomos de flúor, en el que el proceso comprende la etapa de poner en contacto una cetona proquiral de fórmula estructural (2) :

con un polipéptido de transaminasa modificada mejorada descrita en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas para la conversión del compuesto de fórmula (2) en el compuesto de fórmula (1) . En algunas realizaciones del proceso, la Ar de la fórmula (2) es 2, 5 – difluorofenilo o 2, 4, 5 – trifluorofenilo, y R4 es trifluorometilo. En algunas realizaciones del proceso, la Ar de la fórmula (2) es 2, 4, 5 – trifluorofenilo.

11. Un proceso según las reivindicaciones 9 o 10 de preparación de un compuesto de fórmula (1a) :

comprende la etapa de poner en contacto un sustrato de la fórmula (2a) :

con un polipéptido de transaminasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 6 en presencia de un dador del grupo amino en un disolvente orgánico apropiado en las condiciones de reacción adecuadas.

12. El proceso de las reivindicaciones 9, 10 o 11: i) el compuesto de fórmula (I) , el compuesto de fórmula (1) o el compuesto de fórmula (1a) se producen con, al menos, el 90 % de exceso enantiomérico. ii) el compuesto de fórmula (I) , el compuesto de fórmula (1) o el compuesto de fórmula (1a) se producen con, al menos, el 99 % de exceso enantiomérico. iii) En la que el dador del grupo amino se selecciona entre isopropilamina, alanina, ácido 3 – aminobutírico o metilbencilamina, por ejemplo en la que el dador del grupo amino es isopropilamina;

iv) Comprende además la etapa de eliminar el subproducto carbonilo de la reacción, en la que opcionalmente el dador del grupo amino es un aminoácido y el subproducto carbonilo es un ácido ceto, en el que el subproducto carbonilo tiene una presión de vapor mayor que el agua y se elimina el subproducto carbonilo inyectando un gas no reactivo o aplicando un vacío, en el que por ejemplo: a) el gas no reactivo es gas nitrógeno o; b) el dador del grupo amino es isopropilamina y el subproducto carbonilo es acetona;

v) en la que la condición de reacción tiene un pH que oscila entre 7, 0 y 9, 0, como en la que la condición de reacción tiene un pH de 8, 5 o se mantiene el pH añadiendo isopropilamina; vi) en la que la condición de reacción tiene una temperatura que oscila entre 25 y 50 ºC, en la que opcionalmente la condición de reacción tiene una temperatura de 45 ºC. vii) en el que el disolvente comprende dimetilsulfóxido, en el que opcionalmente el dimetilsulfóxido oscila entre un 10 y un 50 % (v / v) , por ejemplo en el que el DMSO tiene un 30 % v / v o; viii) además comprende la etapa de aislamiento del compuesto de la fórmula estructural (I) , del compuesto de la fórmula estructural (1) o del compuesto de la fórmula estructural (1a) de la reacción.

13. El proceso de la reivindicación de las reivindicaciones 10 u 11 que comprenden además la etapa de convertir el compuesto de fórmula estructural (1) o el compuesto de fórmula estructural (1a) en una sal farmacéuticamente aceptable poniendo en contacto dicho compuesto con un ácido farmacéuticamente aceptable en un disolvente de reacción apropiado, opcionalmente:

i) en el que el ácido farmacéuticamente aceptable es ácido fosfórico y la sal farmacéuticamente aceptable es la sal de fosfato dihidrógeno; ii) en el que el compuesto tiene la fórmula estructural (1a) , el ácido aceptable farmacéuticamente es un ácido fosfórico y la sal aceptable farmacéuticamente es una sal de fosfato monohidratado o; iii) comprende la etapa de cristalización de la sal farmacéuticamente aceptable a partir del disolvente de reacción.

14. Una composición que comprende el polipéptido de transaminasa según cualquiera de las reivindicaciones 1

– 6 y:

(a) Un compuesto de fórmula estructural (I) : que tiene la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *; con un exceso enantiomérico de, al menos, el 70 % respecto al enantiómero opuesto, en el que Z es OR2 o NR2R3; R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo; R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo heterocíclico membrado de 4– a 7– que contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, NH y NC1–4 alquilo, sustituyendo, o no, el anillo heterocíclico por uno de los tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, C1–4 alcoxi y C1–4 alquilo, en el que alquilo y alcoxi son sustituidos, o no, por uno a cinco átomos de flúor; y fusionando el sistema del anillo heterocíclico a un sistema de anillos carbocíclicos aromáticos o saturados de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros que contiene de uno o dos heteroátomos seleccionados entre O, S y NC0–4 alquilo, sustituyendo, o no, el sistema de anillos fusionados por uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, amino, flúor, C1–4 alquilo, C1–4 alcoxi y trifluorometil;

(b) Un compuesto de fórmula estructural (1) :

que tiene la configuración – (R) en el centro estereogénico marcado con ***, en el que:

Ar es un fenilo sustituido, o no, por uno a cinco sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; y R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo sustituido, o no por uno a cinco átomos de flúor;

(c)

(d) Un compuesto de fórmula estructural (II)

que tiene la configuración estereoquímica indicada en el centro estereogénico marcado con un *, en el que:

Z es OR2 o NR2R3;

R1 es C1–8 alquilo, arilo, heteroarilo, arilo – C1–2 alquilo o heteroarilo – C1–2 alquilo;

R2 y R3 son hidrógenos independientes, C1–8 alquilo, arilo o arilo – C1–2 alquilo; o R2 y R3 junto al átomo de nitrógeno al que se unen forman un anillo heterocíclico membrado de 4– a 7– que contiene un heteroátomo adicional seleccionado entre O, S, NH y NC1–4 alquilo, sustituyendo, o no, el anillo heterocíclico por uno de los tres sustituyentes seleccionados independientemente entre oxo, hidroxi, halógeno, C1–4 alcoxi y C1–4 alquilo, en el que alquilo y alcoxi son sustituidos, o no, por uno a cinco átomos de flúor; y fusionando el sistema del anillo heterocíclico a un sistema de anillos carbocíclicos aromáticos o saturados de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros o a un sistema de anillos heterocíclicos saturados o aromáticos de 5 a 6 miembros que contiene de uno o dos heteroátomos seleccionados entre O, S y NC0–4 alquilo, sustituyendo, o no, el sistema de anillos fusionados por uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, amino, flúor, C1–4 alquilo, C1–4 alcoxi y trifluorometil;

(e) Un compuesto de fórmula estructural (2) :

en el que:

Ar es un fenilo sustituido, o no, por uno a cinco sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por flúor, trifluorometil y trifluorometoxi; y

R4 es hidrógeno o C1–4 alquilo sustituido, o no, por uno a cinco átomos de flúor; o (f)

15. La composición de la reivindicación 14, comprende además un dador del grupo amino y en la que opcionalmente el dador del grupo amino comprende isopropilamina, alanina, ácido 3 – aminobutírico o metilbencilamina.


 

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