Beta-glucosidasa BGL3 y ácidos nucleicos que la codifican.

Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria de una secuencia que codifica un polipéptidoBGL3, que tiene una identidad de secuencia de al menos 98 % con la secuencia de aminoácidos presentada comoSEQ ID NO: 21 en la tabla 1.

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria de una secuencia que codifica un polipéptidoBGL3 que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1; y

(c) una secuencia de ácido nucleico presentada como SEQ ID NO: 4 en la tabla 1 o la complementaria de la misma;en el que el % de identidad se calcula como la identidad de la secuencia de aminoácidos de BGL3 presentada comoSEQ ID NO: 2 en la tabla 1 a lo largo de su longitud entera, usando el programa CLUSTAL-W de MacVector versión6.5, utilizando los parámetros por defecto que incluyen una penalización de apertura de hueco de 10,0, unapenalización de extensión de hueco de 0,1 y una matriz de similitud BLOSUM 30.

Beta-glucosidasa BGL3 y ácidos nucleicos que la codifican

Apoyo del gobierno [0001] Partes de este trabajo han sido financiadas por el subcontrato n º ZCO-30017-01 con el Laboratorio Nacional de Energías Renovables bajo el contrato principal n º DE-AC36-99GO10337 con el Departamento de Energía de EE.UU. Por consiguiente, el Gobierno de Estados Unidos tiene algunos derechos en esta invención.

Campo de la invención [0002] La presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos de bgl3 aisladas, que codifican polipéptidos que tienen actividad de beta-glucosidasa. La invención también se refiere a construcciones de ácidos nucleicos, vectores y células huésped que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos, así como a procedimientos para producir polipéptidos BGL3 recombinantes.

Referencias [0003]

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Antecedentes de la invención [0004] La celulosa y hemicelulosa son los materiales vegetales más abundantes producidos por fotosíntesis. Los pueden degradar y usar como una fuente de energía numerosos microorganismos incluyendo bacterias, levaduras y hongos, que producen enzimas extracelulares capaces de hidrólisis de los sustratos polímeros a azúcares monómeros (Aro y col., 2001) . Puesto que los límites de las energías no renovables están cerca, el potencial de la celulosa para convertirse en una fuente principal de energía renovable es enorme (Krishna y col., 2001) . La utilización eficaz de la celulosa mediante procesos biológicos es un procedimiento para superar la escasez de alimentos, piensos y combustibles (Ohmiya y col., 1997) .

Las celulasas son enzimas que hidrolizan la celulosa (enlaces beta-1, 4-glucano o beta-D-glucosídico) produciendo la formación de glucosa, celobiosa, celooligosacáridos y similares. Las celulasas tradicionalmente se han dividido en tres clases principales: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ("EG") , exoglucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ("CBH") y beta-glucosidasas ([beta]-D-glucósido glucohidrolasa; EC 3.2.1.21) ("BG") . (Knowles y col., 1987; Shulein, 1988) . Las endoglucanasas actúan principalmente en las partes amorías de la fibra de celulosa, mientras que las celobiohidrolasas también son capaces de degradar la celulosa cristalina (Nevalainen y Penttila, 1995) . Por lo tanto, es necesaria la presencia de una celobiohidrolasa en un sistema de celulasa para la solubilización eficaz de la celulosa cristalina (Suurnakki, y col. 2000) . La beta-glucosidasa actúa para liberar unidades de D-glucosa de la celobiosa, celooligosacáridos, y otros glucósidos (Freer, 1993) .

Se sabe que las celulasas son producidas por un gran número de bacterias, levaduras y hongos. Algunos hongos producen un sistema de celulasa completo capaz de degradar formas cristalinas de la celulosa, de modo que las celulasas son producidas fácilmente en grandes cantidades por fermentación. Los hongos filamentosos tienen una función especial puesto que muchas levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae, carecen de la capacidad para hidrolizar la celulosa. Véase, p. ej., Aro y col., 2001; Aubert y col., 1988; Wood y col., 1988, y Coughlan, y col.

Las clasificaciones de celulasas fúngicas en CBH, EG y BG se pueden ampliar más para incluir múltiples componentes dentro de cada clasificación. Por ejemplo, se han aislado múltiples CBH, EG y BG de una variedad de fuentes fúngicas incluyendo Trichoderma reesei que contiene genes conocidos para 2 CBH, es decir, CBH I y CBH II, al menos 5 EG, es decir, EG I, EG II, EG III, EG IV y EG V, y al menos 2 BG, es decir, BG1 y BG2.

Con el fin de convertir eficazmente celulosa cristalina en glucosa, es necesario el sistema de celulasa completo que comprende componentes de cada una de las clasificaciones de CBH, EG y BG, siendo los componentes aislados menos eficaces en la hidrólisis de la celulosa cristalina (Filho y col., 1996) . Se ha observado una relación sinérgica entre los componentes de la celulasa... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria de una secuencia que codifica un polipéptido BGL3, que tiene una identidad de secuencia de al menos 98 % con la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 21 en la tabla 1.

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria de una secuencia que codifica un polipéptido BGL3 que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1; y

(c) una secuencia de ácido nucleico presentada como SEQ ID NO: 4 en la tabla 1 o la complementaria de la misma;

en el que el % de identidad se calcula como la identidad de la secuencia de aminoácidos de BGL3 presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1 a lo largo de su longitud entera, usando el programa CLUSTAL-W de MacVector versión 6.5, utilizando los parámetros por defecto que incluyen una penalización de apertura de hueco de 10, 0, una penalización de extensión de hueco de 0, 1 y una matriz de similitud BLOSUM 30.

2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido es una molécula de ARN.

3. Un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que codifica una enzima que tiene actividad de 1-glucosidasa, en el que la enzima deriva de una fuente de Trichoderma.

4. El polinucleótido aislado de la reivindicación 3, en el que la enzima deriva de Trichoderma reesei.

5. Una construcción de expresión que incluye una secuencia de polinucleótido (i) que codifica o es complementaria de una secuencia que codifica un polipéptido BGL3 que tiene una identidad de secuencia de al menos 98 % con la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1, o (ii) que es como se define en la reivindicación 2.

6. Un vector que incluye la construcción de expresión de la reivindicación 5.

7. Un vector que comprende un polinucleótido aislado de la reivindicación 1 o reivindicación 2, operativamente unido a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

8. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 7 o la reivindicación 8.

9. Una célula huésped recombinante que comprende un polinucleótido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

10. La célula huésped de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, que es una célula procariota.

11. La célula huésped de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, que es una célula eucariota.

12. Un polipéptido BGL3 purificado con la actividad biológica de una 1-glucosidasa, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 98 % con la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1;

(b) una secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1;

(c) un fragmento biológicamente activo purificado de la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1;

en el que el % de identidad se calcula como la identidad con la secuencia de aminoácidos de BGL3 presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1 a lo largo de toda su longitud.

13. Un procedimiento de producción de una enzima que tiene actividad de 1-glucosidasa, que comprende:

(a) transformar establemente una célula huésped con un vector de expresión que comprende un polinucleótido como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2;

(b) cultivar dicha célula huésped transformada en condiciones adecuadas para que dicha célula huésped produzca dicha 1-glucosidasa; y

(c) recuperar dicha 1-glucosidasa.

14. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la célula huésped es una célula de hongo filamentoso o de levadura.

15. Una enzima purificada que tiene actividad de 1-glucosidasa preparada por el procedimiento de la reivindicación 14.

16. Una célula huésped recombinante que comprende una eliminación o inserción u otra alteración en el gen bgl3 que inactiva el gen y previene la producción del polipéptido BGL3, en la que el polipéptido BGL3 tiene una identidad de secuencia de al menos 98 % con la secuencia del polipéptido BGL3 presentado como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1, en el que el % de identidad se calcula como la identidad de la secuencia de aminoácidos de BGL3 presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1 a lo largo de toda su longitud.

17. Un oligonucleótido de sentido contrario complementario de un ARN mensajero que codifica un polipéptido BGL3 que tiene la secuencia presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1, en el que tras exposición a una célula huésped que produce 1-glucosidasa, dicho oligonucleótido disminuye o inhibe la producción de 1glucosidasa por dicha célula huésped.

18. El oligonucleótido de sentido contrario de la reivindicación 18, en el que la célula huésped es un hongo filamentoso.

19. Una composición de detergente, comprendiendo dicha composición un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 98 % con la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1;

(b) una secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1;

(c) un fragmento biológicamente activo purificado de la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1,

en el que el % de identidad se calcula como la identidad con la secuencia de aminoácidos de BGL3 presentada como SEQ ID NO: 2 en la tabla 1 a lo largo de toda su longitud.

20. Un procedimiento para mejorar las características de una masa de levadura o producto horneado hecho con dicha masa, que consiste esencialmente en las etapas de:

(a) mezclar al menos aproximadamente 10 ppm de un BGL3 de acuerdo con la reivindicación 12 con ingredientes de masa para formar una mezcla de masa, y

(b) hornear dicha mezcla de masa para formar un producto horneado.

21. Un procedimiento para mejorar las características de la masa de pan de levadura o masa de bollo de levadura o pan de levadura o bollo de levadura, que consiste esencialmente en las etapas de:

(a) mezclar al menos aproximadamente 10 ppm de un BGL3 de acuerdo con la reivindicación 12 con ingredientes de masa de pan o de bollo, para formar una mezcla de masa, y

(b) dar forma o moldear la mezcla de masa;

(c) levar la mezcla de masa, y

(d) hornear la mezcla de masa para formar pan o bollos.

22. Un procedimiento para expresar un polipéptido heterólogo que tiene actividad de 1-glucosidasa en una especie de Aspergillus, que comprende:

(a) proporcionar un Aspergillus huésped con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia señal de 1-glucosidasa de Aspergillus unida a un polinucleótido que codifica una 1-glucosidasa heteróloga 3 que comprende la SEQ ID NO: 2 en la tabla 1, codificando así un polipéptido quimérico;

(b) cultivar dicho Aspergillus huésped en condiciones adecuadas para que dicho Aspergillus produzca dicho polipéptido quimérico, en el que se produce dicho polipéptido quimérico.