Métodos y composiciones basados en microARN para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de cáncer de mama.

Un método para diagnosticar cáncer de mama usando al menos miR-21 en el que un aumento en el nivel de expresión de miR-21 en una muestra obtenida de un sujeto en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en un control es indicativo de que el sujeto tiene,

o está en riesgo de desarrollar cáncer de mama.

Métodos y composiciones basados en microARN para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de cáncer de mama Apoyo del gobierno La presente invención fue apoyada, en su totalidad o en parte, por una subvención bajo las Subvenciones del Proyecto de Programa Nº P01CA76259, P01CA81534 y P30CA56036 del Instituto de Cáncer Nacional. El Gobierno tiene determinados derechos sobre esta invención.

Antecedentes El cáncer de mama es un problema de salud significativo para mujeres en los Estados Unidos y en todo el mundo. Aunque se han realizado avances en la detección y el tratamiento de la enfermedad, el cáncer de mama sigue siendo la segunda causa principal de muertes relacionadas con cáncer en mujeres, afectando a más de 180.000 mujeres en los Estados Unidos cada año. Para las mujeres en Norteamérica, las probabilidades en tiempo de vida de tener cáncer de mama son ahora de una de cada ocho.

No está disponible en la actualidad ningún método universalmente exitoso para el tratamiento o prevención de cáncer de mama. El tratamiento del cáncer de mama se basa en la actualidad en una combinación de diagnóstico temprano (por ejemplo, mediante procedimientos de exploración de mama rutinarios) y tratamiento agresivo, que puede incluir uno o más de diversos tratamientos, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapia hormonal. El ciclo de tratamiento para un cáncer de mama particular se selecciona con frecuencia basándose en diversos parámetros de pronóstico incluyendo un análisis de marcadores tumorales específicos. Véase, por ejemplo, Porter-Jordan y Lippman, Breast Cancer 8: 73-100 (1994) .

Aunque el descubrimiento de BRCA1 y BRCA2 fueron etapas importantes en la identificación de factores genéticos clave implicados en cáncer de mama, se ha hecho evidente que las mutaciones en BRCA1 y BRCA2 representan solamente una fracción de la susceptibilidad heredada a cáncer de mama (Nathanson, K. L., et al., Human Mol. Gen. 10 (7) : 715-720 (2001) ; Anglican Breast Cancer Study Group. Br. J. Cancer 83 (10) : 1301-08 (2000) ; y Syrjakoski, K., et al., J. Natl. Cancer Inst. 92: 1529-31 (2000) ) . A pesar de investigación considerable sobre terapias para cáncer de mama, el cáncer de mama sigue siendo difícil de diagnosticar y tratar eficazmente, y la alta mortalidad observada en pacientes con cáncer de mama indica que se necesitan mejoras en el diagnóstico, tratamiento y prevención de la enfermedad.

Los microARN son una clase de ARN no codificantes, pequeños que controlan la expresión génica hibridando con y desencadenando la represión de la traducción o, menos frecuentemente, la degradación de una diana de ARN mensajero (ARNm) . El descubrimiento y estudio de los miARN ha revelado mecanismos reguladores de genes mediados por miARN que desempeñan papeles importantes en el desarrollo de los organismos y diversos procesos celulares, tales como diferenciación celular, crecimiento celular y muerte celular (Cheng, A. M., et al., Nucleic Acids Res. 33: 1290-1297 (2005) ) . Estudios recientes sugieren que la expresión aberrante de los miARN particulares puede estar implicada en enfermedades humanas, tales como trastornos neurológicos (Ishizuka, A., et al., Genes Dev. 16: 2497-2508 (2002) ) y cáncer. En particular, se ha descubierto expresión errónea de miR-16-1 y/o miR-15a en leucemias linfocíticas crónicas humanas (Calin, G. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 15524-15529 (2002) ) .

El desarrollo y el uso de micromatrices que contienen todos los microARN humanos conocidos ha permitido un análisis simultáneo de la expresión de cada miARN en una muestra (Liu, C.G., et al., Proc Natl. Acad. Sci U.S.A.

101: 9740-9744 (2004) ) . Estas micromatrices de microARN no se han usado solamente para confirmar que miR-16-1 está desregulado en células CLL humanas, sino también para generar identificaciones de expresión de miARN que se asocian con características clínico patológicas bien definidas de CLL humano (Calin, G. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 1175-11760 (2004) ) .

Se usó un método de realización de perfiles de expresión de miARN citométrico basado en perlas en un estudio para presentar un análisis de expresión sistemática de miARN de mamífero de muestras, incluyendo cánceres humanos. Los perfiles de miARN reflejaron el linaje de desarrollo y estado de diferenciación de los tumores (Lu et al., Nature 435: 835-838 (2004) ) . Otro estudio sugiere que la mayoría de genes de miR pueden hallarse en regiones genómicas asociadas con cáncer o en sitios frágiles (Calin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 2999-3004 (2004) ) .

El uso de micromatrices de microARN para identificar un grupo de microARN, que se expresan diferencialmente entre células normales y células de cáncer de mama (es decir, una identificación de expresión o perfil de expresión) , puede ayudar a determinar miARN específicos que están implicados en el cáncer de mama. Además, la identificación de dianas potenciales de estos miARN puede ayudar a desentrañar su papel patógeno. La presente divulgación proporciona nuevos métodos y composiciones para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de cáncer de mama.

Sumario La presente divulgación se basa, en parte, en la identificación de un distintivo específico de cáncer de mama de miARN que se expresan diferencialmente en células de cáncer de mama, en relación con células de control normales. En consecuencia, en un aspecto la invención proporciona un método para diagnosticar cáncer de mama usando al menos miR-21 en el que un aumento en el nivel de expresión de miR-21 en una muestra obtenida de un sujeto en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en un control es indicativo de que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer de mama. Una alteración (por ejemplo, un aumento, una reducción) en el nivel del producto génico de miR en la muestra de ensayo, en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativa de que el sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar, cáncer de mama. En ciertas realizaciones, el al menos un producto génico de miR se selecciona del grupo que consiste en miR-125b-1, miR-125b-2, miR-145, miR-21, miR-155, miR-10 y combinaciones de los mismos.

El nivel del al menos un producto génico de miR puede medirse usando diversas técnicas que se conocen bien por los expertos en la materia. En una realización, el nivel del al menos un producto génico de miR se mide usando análisis de transferencia de Northern. En otra realización, el nivel del al menos un producto génico se mide por transcripción inversa de ARN de una muestra de ensayo obtenida del sujeto para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana, hibridando los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo, y comparando el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado de una muestra de control. Una alteración en la señal de al menos un miARN en la muestra de ensayo en relación con la muestra de control es indicativa de que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer de mama. La micromatriz puede comprender oligonucleótidos sonda específicos de miARN para una parte sustancial del miRNoma humano. La micromatriz puede comprender oligonucleótidos sonda específicos de miARN para uno o más miARN seleccionados del grupo que consiste en miR-145, miR-21, miR-155, miR-10b, miR-009-1 (miR131-1) , miR-34 (miR-170) , miR-102 (miR-29b) , miR-123 (miR-126) , miR-140-as, miR-125a, miR-125b-1, miR-125b-2, miR-194, miR-204, miR-213, let7a-2, let-7a-3, let-7d (let-7dv1) , let-7f-2, let-7i (let-7d-v2) , miR-101-1, miR-122a, miR-128b, miR-136, miR-143, miR149, miR-191, miR-196-1, miR-196-2, miR-202, miR-203, miR205, miR-206, miR-210 y combinaciones de los mismos. En otro aspecto, la invención también proporciona un método para diagnosticar un cáncer de mama asociado con estadio tumoral avanzado en un sujeto, que comprende medir el nivel de expresión de al menos miR21 en el que un aumento en el nivel de expresión del al menos miR-21 en una muestra obtenida de un sujeto, en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativo de que el sujeto tiene un cáncer de mama asociado con estadio tumoral avanzado.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona un método para diagnosticar cáncer de mama de estadio tumoral avanzado, que comprende:

(1) transcribir de forma inversa ARN de una muestra de ensayo para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana;... [Seguir leyendo]

1. Un método para diagnosticar cáncer de mama usando al menos miR-21 en el que un aumento en el nivel de expresión de miR-21 en una muestra obtenida de un sujeto en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en un control es indicativo de que el sujeto tiene, o está en riesgo de desarrollar cáncer de mama.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el nivel de al menos miR-21 se mide usando análisis de transferencia de Northern.

3. Un método para diagnosticar un cáncer de mama asociado a estadio tumoral avanzado en un sujeto, que comprende medir el nivel de expresión de al menos miR-21 en donde un aumento en el nivel de expresión del al menos miR-21 en una muestra obtenida de un sujeto, en relación con el nivel de un producto génico de miR correspondiente en una muestra de control, es indicativo de que el sujeto tiene un cáncer de mama asociado a estadio tumoral avanzado.

4. Un método para diagnosticar cáncer de mama en estadio tumoral avanzado, que comprende:

(1) transcribir de forma inversa ARN de una muestra de ensayo para proporcionar un conjunto de oligodesoxinucleótidos diana;

(2) hibridar los oligodesoxinucleótidos diana con una micromatriz que comprende oligonucleótidos sonda específicos de miARN para proporcionar un perfil de hibridación para la muestra de ensayo; y

(3) comparar el perfil de hibridación de la muestra de ensayo con un perfil de hibridación generado a partir de una muestra de control, en donde un aumento en el nivel de expresión de al menos miR-21 en la muestra de ensayo en comparación con un nivel de expresión de miR-21 en una muestra de control es indicativo de que el sujeto tiene cáncer de mama en estadio tumoral avanzado.

5. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1, 3 o 4 en el que se usa miR-21 en combinación con uno o más de miR-125b-1, miR-125b-2, miR-145, miR-155, miR-10b y combinaciones de los mismos.