Bacterinas tratadas térmicamente y vacunas en emulsión preparadas a partir de tales bacterinas tratadas térmicamente.

Una vacuna en emulsión que comprende (a) una emulsión que comprende un aceite y uno o más emulsionantes,

y (b)una bacterina de Leptospira tratada térmicamente que comprende una suspensión de bacterias Leptospira muertas quetienen una actividad de lipasa del 50% o inferior a la actividad de lipasa de la bacterina antes del tratamiento térmico, yque tiene actividad antigénica aceptable; en la que dicha bacterina de Leptospira tratada térmicamente está preparadamediante un procedimiento que comprende calentar la bacterina a una temperatura de 60 a 70 ºC durante 5 a 10 horas.

Bacterinas tratadas térmicamente y vacunas en emulsión preparadas a partir de tales bacterinas tratadas térmicamente

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere generalmente al campo de las vacunas y a procedimientos de estabilización de vacunas en emulsión. En particular, la presente invención se refiere a bacterinas tratadas térmicamente, a un procedimiento de producción de bacterinas tratadas térmicamente y a vacunas en emulsión preparadas a partir de tales bacterinas tratadas térmicamente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La vacunación se usa cada vez más para combatir enfermedades infecciosas en animales. Los adyuvantes se usan frecuentemente en vacunas debido a que pueden aumentar la respuesta inmunitaria humoral y/o celular a un antígeno. Las vacunas se formulan frecuentemente como emulsiones debido a que la emulsión puede actuar de adyuvante y tiene la propiedad de retener el antígeno como un depósito en el sitio de inyección. Los emulsionantes se usan comúnmente en vacunas en emulsión. Además de usar emulsionantes, la estabilidad de las vacunas en emulsión también puede lograrse reduciendo el tamaño de gotita de la emulsión por medios mecánicos.

La patente de EE.UU. nº 5.084.269 se refiere a una formulación de adyuvante que contiene lecitina en combinación con aceite mineral que produce menos irritación dentro del animal huésped, y simultáneamente induce elevada inmunidad sistémica. Las composiciones según la patente de EE.UU. 5.084.269 están en uso comercial bajo el nombre comercial AMPHIGEN®, una marca registrada de Pfizer, Inc.

Generalmente, los antígenos bacterianos son inestables cuando se calientan e incluso una breve exposición a temperaturas elevadas puede reducir la actividad de los antígenos. Por ejemplo, las actuales vacunas anticarbuncosas pueden perder toda la actividad biológica en 48 horas a 37 ºC (S. Sing, N. Ahuja, V. Chauhan, E. Rajasekaran, W. S. Mohsin, R. Bhat, y R. Bhatnagar; Bioche. Biophys. Res. Commun. 2002 Sep. 6; 295 (5) :1058-62) . Zeigler y col. (Bulletin of the Pan American Health Organization, vol.10 (Nº2) :126-130 (1976) ) describe vacunas basadas en bacterina de Leptospira en las que la inactivación se lleva a cabo a 56 ºC durante 30 min.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a bacterinas de Leptospira tratadas térmicamente, a un procedimiento de producción de bacterinas de Leptospira tratadas térmicamente y a vacunas en emulsión preparadas a partir de tales bacterinas tratadas térmicamente. El procedimiento comprende calentar la bacterina a una temperatura de 60 a 70 ºC durante 5 a 10 horas para formar una bacterina tratada térmicamente.

La invención proporciona una vacuna en emulsión que comprende (a) una emulsión que comprende un aceite y uno o más emulsionantes, y (b) una bacterina de Leptospira tratada térmicamente que comprende una suspensión de bacterias Leptospira muertas que tienen una actividad de lipasa del 50% o inferior a la actividad de lipasa de la bacterina antes del tratamiento térmico, y que tienen aceptable actividad antigénica; en la que dicha bacterina de Leptospira tratada térmicamente está preparada mediante un procedimiento que comprende calentar la bacterina a una temperatura de 60 a 70 ºC durante 5 a 10 horas.

La invención proporciona además una vacuna en emulsión que comprende bacterinas de Leptospira, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona canicola tratadas térmicamente obtenidas mediante calentamiento de las bacterinas a una temperatura de 65 ºC durante 8 horas, y que comprende además AMPHIGEN®, adyuvantes, conservantes y tampón diluyente de manera que la concentración de las bacterinas sea 1200 UN/5 ml de dosis para todas las bacterinas de Leptospira, excepto Leptospira hardjo, que es 2400 UN/5 ml de dosis, vacuna en emulsión que se ha homogeneízado y microfluidizado, y luego se le ha ajustado el pH a pH 7, 0-7, 3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

DEFINICIONES

Actividad antigénica aceptable -El término “actividad antigénica aceptable” significa la capacidad para inducir una 45 respuesta inmunitaria protectora en animales vacunados después de provocarse o de pasar una prueba de potencia codificada con organismo vivo homólogo.

Bacterina -El término “bacterina” significa una suspensión de bacterias muertas que puede usarse como componente de una vacuna.

Emulsionante -El término “emulsionante” significa una sustancia usada para preparar una emulsión más estable.

Emulsión -El término “emulsión” significa una composición de dos líquidos inmiscibles en la que pequeñas gotitas de un líquido están suspendidas en una fase continua del otro líquido.

Bacterina tratada térmicamente -El término “bacterina tratada térmicamente” significa una bacterina que se ha tratado con calor y que tiene una actividad de lipasa del 50% o inferior a la actividad de lipasa antes del tratamiento térmico, y que 5 tiene actividad antigénica aceptable.

Emulsión inversa -El término “emulsión inversa” significa una emulsión de agua en aceite.

Lipasa -El término “lipasa” significa enzimas esterasas, lipasas y fosfolipasas que pueden producir la rotura de un emulsionante en una vacuna en emulsión.

Emulsión normal -El término “emulsión normal” significa una emulsión de aceite en agua.

Emulsión de aceite en agua -El término “emulsión de aceite en agua” significa una emulsión en la que pequeñas gotitas de aceite están suspendidas en una fase acuosa continua.

Temperatura ambiente -El término “temperatura ambiente” significa una temperatura de 18 a 25 ºC.

Emulsión de agua en aceite -El término “emulsión de agua en aceite” significa una emulsión en la que gotitas de agua están suspendidas en una fase aceitosa continua.

DESCRIPCIÓN

La presente invención se refiere a bacterinas de Leptospira con actividad de lipasa reducida, vacunas en emulsión preparadas a partir de tales bacterinas y a un procedimiento de reducir la actividad de lipasa de bacterinas. Además de componentes antigénicos, algunas bacterinas tienen actividad de lipasa. Cuando las bacterinas con actividad de lipasa se incorporan en una emulsión, la lipasa puede romper los emulsionantes usados para crear la emulsión. Las vacunas en 20 emulsión que contienen bacterinas que tienen alta actividad de lipasa tienden a ser emulsiones inestables, y aquellas que contienen bacterinas que tienen bajos niveles de lipasa tienden a ser estables. Ejemplos de bacterias que pueden, cuando mueren, producir bacterinas que tienen actividad de lipasa incluyen Acinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter 25 jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia trachomatis, Chromobacterium viscosum, Er y sipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Lawsonia intracellularis, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Photorhabdus luminescens, Propionibacterium acnes, Proteus vulgaris, Pseudomonas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, 30 Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Alcaliges eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Spirlina platensis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium y especies de Leptospira, tales como los patógenos conocidos Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona.

La lipasa, que puede romper los emulsionantes usados para crear la emulsión, y así producir inestabilidad y rotura de la emulsión, puede incluir una o más enzimas que rompen emulsiones tales como esterasas, lipasas y fosfolipasas. Conjuntamente, estas enzimas, esterasas, lipasas y fosfolipasas se denominan lipasa. La actividad de lipasa de una 40 bacterina puede... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna en emulsión que comprende (a) una emulsión que comprende un aceite y uno o más emulsionantes, y (b) una bacterina de Leptospira tratada térmicamente que comprende una suspensión de bacterias Leptospira muertas que tienen una actividad de lipasa del 50% o inferior a la actividad de lipasa de la bacterina antes del tratamiento térmico, y

que tiene actividad antigénica aceptable; en la que dicha bacterina de Leptospira tratada térmicamente está preparada mediante un procedimiento que comprende calentar la bacterina a una temperatura de 60 a 70 ºC durante 5 a 10 horas.

2. Una vacuna en emulsión según la reivindicación 1, en la que dicha bacterina de Leptospira tratada térmicamente está preparada mediante un procedimiento que comprende calentar la bacterina a una temperatura de 65 ºC durante 8 horas.

3. Una vacuna en emulsión según las reivindicaciones 1 ó 2, en la que las bacterias Leptospira muertas son de una a

cinco especies de Leptospira seleccionadas del grupo constituido por Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona.

4. Una vacuna en emulsión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además virus vivos.

5. Una vacuna en emulsión según la reivindicación 4, en la que los virus vivos son de uno a tres virus seleccionados del

grupo constituido por virus de la rinotraqueítis bovina (RBI) , virus de la paragripe 3 (PI3) y virus respiratorio sincitial bovino 15 (VRSB) .

6. Una vacuna en emulsión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además virus muertos.

7. Una vacuna en emulsión según la reivindicación 6, en la que los virus muertos son de uno a dos virus seleccionados del grupo constituido por diarrea vírica bovina tipo 1 (DVB) y diarrea vírica bovina tipo 2 (DVB) .

8. Una vacuna en emulsión según la reivindicación 1, que comprende además una preparación de lecitina, Quil A y 20 colesterol.

9. Un procedimiento de preparación de la bacterina de Leptospira tratada térmicamente de la vacuna en emulsión de la reivindicación 1, que comprende las etapas de: (a) medir la actividad de lipasa de la bacterina; (b) calentar la bacterina a una temperatura de 60 a 70 ºC durante 5 a 10 horas; (c) medir la actividad de lipasa de la bacterina después del tratamiento térmico; (d) comparar la actividad de lipasa de la bacterina antes de calentar con la actividad de lipasa de la bacterina después de calentar; y (e) seleccionar una bacterina tratada térmicamente en la que la actividad de lipasa después del tratamiento térmico sea del 50% o menos de la actividad de lipasa de la bacterina antes del tratamiento térmico.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que la bacterina se calienta a una temperatura de 65 ºC durante 8 horas.

11. Un procedimiento de producción de la vacuna en emulsión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

12. Una vacuna en emulsión que comprende bacterinas de Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona tratadas térmicamente obtenidas mediante calentamiento de las bacterinas a una temperatura de 65 ºC durante 8 horas, y que comprende además AMPHIGEN®, adyuvantes, conservantes y tampón diluyente de manera que la concentración de las bacterinas sea 1200 UN/5 ml de dosis para todas las bacterinas de Leptospira, excepto Leptospira hardjo, que es 2400 UN/5 ml de dosis, vacuna en emulsión que se ha homogeneízado y microfluidizado, y luego se le ha ajustado el pH a pH 7, 0-7, 3.