Un mutante de una bacteria Gram negativa, en el que dicha bacteria tiene una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad que es igual o mayor que 80%,

85%, 90%, 95%, 96%, 97%; 98% o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 90, dando dicha mutación como resultado una virulencia atenuada de la bacteria

Bacterias Gram negativas atenuadas.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a bacterias vivas Gram negativas atenuadas que se pueden usar en composiciones inmunógenas o en composiciones de vacuna para la prevención de infecciones bacterianas. Las bacterias atenuadas pueden actuar como un vector de expresión para expresar inmunógenos procedentes de otros agentes patógenos. Se ha encontrado que los polipéptidos codificados por las secuencias de nucleótidos o genes que son dianas apropiadas para la atenuación de bacterias pueden usarse como compuestos inmunógenos especialmente en composiciones inmunógenas o en composiciones de vacuna.

Antecedentes de la invención

Está bien establecido que los microorganismos vivos atenuados pueden ser vacunas muy eficaces; las respuestas inmunes estimuladas por dichas vacunas son a menudo de mayor magnitud y de duración más larga que las producidas por inmunógenos no replicantes. Una explicación de esto puede ser que las cepas vivas atenuadas establecen infecciones limitadas en el huésped e imitan las etapas tempranas de la infección natural. Adicionalmente, a diferencia de las preparaciones muertas, las vacunas vivas son capaces son capaces de inducir potentes respuestas mediadas por células que se pueden relacionar con su capacidad para replicarse en células que presentan antígenos, tales como los macrófagos.

Existe una larga historia del uso de vacunas atenuadas vivas en animales y seres humanos, usando especialmente técnicas de mutagénesis química, sin embargo, las vacunas empíricamente atenuadas pueden revertir a virulentas.

Las técnicas modernas de la biología molecular, junto con el aumento del conocimiento de la patogénesis bacteriana, han conducido a la identificación de varios genes que están implicados en el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos in vivo. Esto ha proporcionado nuevos genes diana para la atenuación y el concepto de que se podrían atenuar "racionalmente" futuras cepas de vacuna introduciendo mutaciones no revertientes definidas en genes seleccionados conocidos por estar implicados en la virulencia, véanse por ejemplo los documentos WO-A-00161724, WO-A-00/68261 y EP-A-0889120.

Aunque se han producido muchas cepas atenuadas en laboratorios, sólo unas pocas se han calificado como potenciales vacunas candidatas para uso en animales. Esto puede ser debido en parte a la necesidad de equilibrar la inmunogenicidad de la vacuna con la posibilidad del microorganismo de revertir, volviéndose reactivo y patogénico.

Es evidente que la selección de los genes apropiados para la atenuación, que se reubicarán en una vacuna candidata adecuada, no es sencilla y no se puede predecir fácilmente. Muchos factores pueden tener influencia sobre la aceptabilidad del mutante atenuado como vacuna, y en consecuencia, se requiere un esfuerzo de investigación para identificar y seleccionar genes atenuantes adecuados. Se llevaron a cabo muchos experimentos de atenuación únicamente in vitro y sus resultados no se pueden extrapolar in vivo, especialmente, en relación con la patogenicidad residual de los mutantes resultantes de los animales vacunados.

Es por tanto deseable caracterizar los genes implicados en la atenuación y sobre esta base desarrollar bacterias atenuadas así como vacunas atenuadas, que tengan en particular un elevado grado de inmunogenicidad y que presenten un buen perfil de seguridad con efectos secundarios limitados o sin efectos secundarios.

Descripción de la invención

La presente descripción se refiere a la identificación de las secuencias de nucleótidos y los genes implicados en la atenuación de un microorganismo. Las mutaciones introducidas en estas secuencias de nucleótidos y genes producen novedosos mutantes atenuados. Estos mutantes son útiles para la producción de composiciones inmunógenas atenuadas vivas o vacunas atenuadas vivas que tienen un elevado grado de inmunogenicidad.

La presente invención proporciona un mutante de una bacteria Gram negativa, en el que dicha bacteria tiene una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad que es igual o más de un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 90 de dicha mutación que da como resultado una virulencia atenuada de la bacteria.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunógena que comprende un mutante atenuado según la presente invención, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Además, la presente invención proporciona una vacuna que comprende un mutante atenuado según la presente invención, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona, en otro aspecto, el uso de un mutante de una bacteria Gram negativa según la presente invención en la producción de una composición o preparación inmunógena atenuada viva de una composición de vacuna atenuada viva.

La presente invención proporciona, en un aspecto adicional, una composición inmunógena según la presente invención, o una vacuna según la presente invención, para uso en la inmunización contra o la prevención de una infección bacteriana en un animal.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un mutante de una bacteria Gram negativa según la presente invención, una composición inmunógena según la presente invención, o una vacuna según la presente invención, en la preparación de un medicamento para la inmunización contra o la prevención de una infección bacteriana en un animal.

En un primer aspecto, la descripción proporciona bacterias que contienen una mutación atenuante en una secuencia de nucleótidos o un gen en el que la mutación modifica, reduce o suprime la expresión y/o la actividad biológica de un polipéptido o proteína codificada por un gen, dando como resultado una virulencia atenuada de la bacteria.

La mutación no se localiza necesariamente en el interior de un gen para perturbar su función, conduciendo a la atenuación. Se puede llevar a cabo también la mutación en las secuencias de nucleótidos implicadas en la regulación de la expresión del gen, en regiones concretas que regulan el inicio de la transcripción, la finalización de la traducción y la transcripción. De esta manera, están incluidos también los promotores y las regiones de unión a los ribosomas (en general, estos elementos reguladores están situados aproximadamente entre los nucleótidos 60 y 250 en la dirección 5' del codón de inicio del gen, Doree S M y col., J. Bacteriol. 2001, 183(6): 1-983-9; Pandher K y col., Infect. Imm. 1998, 66(12): 5613-9; Chung J Y y col., FEMS Microbiol Letters 1998, 166: 289-296), finalizadores de la transcripción (en general, el finalizador se localiza en aproximadamente 50 ácidos nucleicos en la dirección 3' del codón de detención del gen; Ward C K y col., Infect. Imm. 1998, 66(7): 3326-36). En el caso de un operón, se pueden localizar dichas regiones reguladoras en una distancia mayor en la dirección 5' del gen. Algunas veces, una mutación en una región intergénica puede conducir también a la atenuación.

Una mutación en el interior de dichas secuencia reguladoras asociadas con el gen de tal manera que la mutación de esta secuencia de nucleótidos modifica, inhibe o suprime la expresión y/o la actividad biológica del polipéptido o la proteína codificada por el gen, da como resultado una virulencia atenuada de la bacterias que sería equivalente a una mutación en el interior de un gen identificado en el presente documento.

La atenuación reduce o suprime la patogenicidad de las bacterias y la gravedad de los signos o lesiones clínicas, disminuye la velocidad de crecimiento de las bacterias y evita la muerte.

La invención se refiere a bacterias Gram negativas, más concretamente a la familia Pasteurellaceae, especialmente a Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae. La bacteria preferida es Pasteurella multocida.

Pasteurella multocida es una bacteria Gram negativa, que es el agente causante de diversas enfermedades de animales de producción y un patógeno humano oportunista. Es el agente etiológico de la pasteurolosis grave, tales como la cólera desatada en pájaros domésticos y silvestres, septicemia hemorrágica bovina y rinitis...

1. Un mutante de una bacteria Gram negativa, en el que dicha bacteria tiene una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad que es igual o mayor que 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%; 98% o 99% con una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 90, dando dicha mutación como resultado una virulencia atenuada de la bacteria.

2. El mutante de la reivindicación 1, en el que la bacteria es una Pasteurellaceae.

3. El mutante de la reivindicación 2, en el que la bacteria se escoge entre el grupo de: Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Pasteurella anatipestifer y Actinobacillus pleuropneumoniae.

4. El mutante de la reivindicación 3, en el que la bacteria es Pasteurella multocida.

5. El mutante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la mutación es una delección en la secuencia de nucleótidos, o una inserción en ésta o la sustitución de ácidos nucleicos.

6. El mutante de la reivindicación 5, en el que la mutación es una delección de la secuencia completa de nucleótidos.

7. El mutante de la reivindicación 5, en el que la inserción se lleva a cabo entre los nucleótidos 802-803 en la SEC DE ID Nº: 90.

8. El mutante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica inmunógenos de un agente vírico, parasítico o bacteriano patógeno, de una proteína terapéutica, de un alérgeno, de un factor de crecimiento o de una citocina.

9. Una composición inmunógena que comprende un mutante atenuado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. La composición inmunógena de la reivindicación 9 que comprende adicionalmente un adyuvante.

11. Una vacuna que comprende un mutante atenuado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. La vacuna de la reivindicación 11 que comprende adicionalmente un adyuvante.

13. Uso de un mutante de una bacteria Gram negativa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la producción de una composición inmunógena atenuada viva o en la preparación de una composición de vacuna atenuada viva.

14. Una bacteria Gram negativa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, una composición inmunógena según la reivindicación 9 ó 10, o una vacuna según la reivindicación 11 ó 12, para uso en la inmunización contra o en la prevención de una infección bacteriana en un animal.

15. Uso de un mutante de una bacteria Gram negativa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, una composición inmunógena según la reivindicación 9 ó 10, o una vacuna según la reivindicación 11 ó 12, en la preparación de un medicamento para la inmunización contra o en la prevención de una infección bacteriana en un animal.