Bacteria que puede producir una sustancia de purina y procedimiento para producir una sustancia de purina.

Procedimiento para producir una sustancia derivada de purina, que comprende:

cultivar una bacteria perteneciente al género Bacillus que presenta una capacidad de producir una sustanciaderivada de purina en un medio para provocar la acumulación de la sustancia derivada de purina en células de labacteria o el medio, y recoger la sustancia derivada de purina a partir de las células o del medio,

en el que la bacteria ha sido modificada de manera que la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa sereduce en comparación con una cepa no modificada mediante la alteración de un gen codificante de fructosabisfosfatasa, o reduciendo la cantidad de expresión del gen codificante de fructosa bisfosfatasa,en el que el gen codificante de fructosa bisfosfatasa es un gen codificante de una proteína de (A) o (B)siguientes:

(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2,

(B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 que incluye sustituciones,deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 10 residuos aminoácidos y presenta actividad defructosa bisfosfatasa, y

en el que la sustancia derivada de purina es un nucleósido de purina seleccionado de entre el grupo queconsiste en inosina, xantosina, guanosina y adenosina o un nucleótido de purina seleccionado de entre elgrupo que consiste en ácido inosínico, ácido xantílico, ácido guanílico y ácido adenílico.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2007/058356.

Solicitante: AJINOMOTO CO., INC..

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 15-1, KYOBASHI 1-CHOME, CHUO-KU TOKYO 104-8315 JAPON.

Inventor/es: MATSUNO, KIYOSHI, ASAHARA,TAKAYUKI, MORI,YUKIKO.

Fecha de Publicación: 23 de Abril de 2013.

Clasificación Internacional de Patentes:

C12N1/21 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
C12N9/16 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces éster (3.1).
C12P19/32 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › con un sistema cíclico condensado, que contiene un ciclo de seis miembros, con dos átomos de nitrógeno en el mismo ciclo, p. ej. nucleótidos púricos, dinucleótido de la nicotinamida-ademina.
C12P19/40 C12P 19/00 […] › con un sistema cíclico condensado, que contiene un ciclo de seis miembros, con dos átomos de nitrógeno en el mismo ciclo, p. ej. nucleósidos púricos.
C12R1/125 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS. › C12R 1/00 Microorganismos. › Bacillus subtilis.

PDF original: ES-2401607_T3.pdf

Fragmento de la descripción:

Bacteria que puede producir una sustancia de purina y procedimiento para producir una sustancia de purina.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir sustancias derivadas de purina, tales como nucleótidos de purina, incluyendo típicamente el ácido 5'-inosínico y el ácido 5'-guanílico, y nucleótidos de purina tales como la inosina y la guanosina, las cuales son sustancias importantes como materias primas para la síntesis de los nucleótidos de purina, utilizando una bacteria perteneciente al género Bacillus utilizada para el procedimiento. Las sustancias derivadas de purina resultan útiles como condimentos, fármacos, materias primas de los mismos, y otros.

Antecedentes de la técnica Son conocidos procedimientos para producir inosina y guanosina mediante la fermentación utilizando cepas auxotróficas de adenina de bacterias Bacillus y derivados de las mismas dotadas adicionalmente de resistencia a diversos fármacos, tales como análogos de purina (documentos de patente nº 1 a nº 8) , y microorganismos de este tipo del género Brevibacterium (documentos de patente nº 9 y nº 10, documento no de patente nº 1) , etc.

Dichas cepas mutantes típicamente se obtienen mediante tratamiento de un microorganismo con irradiación ultravioleta o nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina) y selección de un mutante diana utilizando un medio de selección adecuado.

Además, también se han cultivado cepas que producen sustancias derivadas de purina utilizando técnicas de ingeniería genética en bacterias Bacillus (documentos de patente nº 11 a nº 20) , en bacterias Brevibacterium (documento de patente nº 21) y bacterias Escherichia (documento de patente nº 22) . Específicamente, por ejemplo, se da a conocer un procedimiento para producir eficientemente un compuesto derivado de ácidos nucleicos, tal como hipoxantina, uracilo, guanina y adenina con una bacteria Bacillus en la que se ha interrumpido un gen (purR) codificante del represor del operón de la purina (documento de patente nº 23) .

En Bacillus subtilis, el represor del operón de la purina tal como se ha indicado anteriormente es conocido que regula, aparte de los genes del operón de la purina, el gen purA, que participa en la biosíntesis del AMP (documento no de patente nº 2) , el gen glyA, que participa en la biosíntesis del ácido formiltetrahidrofólico (documento no de patente nº 3) , el gen pbuG, que codifica el transportador de hipoxantina/guanina (documento no de patente nº 4) , y otros.

Además, se da a conocer un microorganismo que produce eficientemente inosina derivado al proporcionar auxotrofía de la adenina mediante la interrupción del gen de la succinil-AMP sintasa (purA) , además de la interrupción del gen purR y la supresión de la descomposición de la inosina en hipoxantina por la interrupción del gen de la purina nucleósido fosforilasa (deoD) , y un procedimiento para producir inosina utilizando el microorganismo (documento de patente nº 8) .

La fructosa bisfosfatasa es uno de los enzimas gluconeogénicos, que cataliza la reacción de generación de fructosa6-fosfato a partir de fructosa-1, 6-bisfosfato. Se conoce poco sobre la relación entre este enzima y la ruta biosintética de las sustancias derivadas de purinas y no se ha intentado producir una bacteria productora de sustancia derivada de purina mediante la reducción de la actividad de este enzima.

Documento de patente nº 1: publicación de patente japonesa (KOKOKU) nº 38-23099.

Documento de patente nº 2: publicación de patente japonesa nº 54-17033.

Documento de patente nº 3: publicación de patente japonesa nº 55-2956.

Documento de patente nº 4: publicación de patente japonesa nº 55-45199.

Documento de patente nº 5: publicación de patente japonesa nº 57-14160.

Documento de patente nº 6: publicación de patente japonesa nº 57-41915.

Documento de patente nº 7: patente japonesa abierta al público (KOKAI) nº 59-42895.

Documento de patente nº 8: patente japonesa abierta al público nº 2004-242610.

Documento de patente nº 9: publicación de patente japonesa nº 51-5075.

Documento de patente nº 10: publicación de patente japonesa nº 58-17592. Documento de patente nº 11: patente japonesa abierta al público nº 58-158197. 5 Documento de patente nº 12: patente japonesa abierta al público nº 58-175493. Documento de patente nº 13: patente japonesa abierta al público nº 59-28470. Documento de patente nº 14: patente japonesa abierta al público nº 60-156388. 10 Documento de patente nº 15: patente japonesa abierta al público nº 1-27477. Documento de patente nº 16: patente japonesa abierta al público nº 1-174385. 15 Documento de patente nº 17: patente japonesa abierta al público nº 3-58787. Documento de patente nº 18: patente japonesa abierta al público nº 3-164185. Documento de patente nº 19: patente japonesa abierta al público nº 5-84067. 20 Documento de patente nº 20: patente japonesa abierta al público nº 5-192164. Documento de patente nº 21: patente japonesa abierta al público nº 63-248394. 25 Documento de patente nº 22: publicación de patente internacional nº WO99/03988 Documento de patente nº 23: patente US nº 6.284.495. Documento no de patente nº 1: Agric. Biol. Chem. 42:399-405, 1978. 30 Documento no de patente nº 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7455-7459, 1995. Documento no de patente nº 3: J. Bacteriol. 183:6175-6183, 2001. 35 Documento no de patente nº 4: J. Bacteriol. 185:5200-5209, 2003.

Exposición de la invención Objetivos que deben ser alcanzados por la invención

Un objetivo de la presente invención es construir una bacteria Bacillus adecuada para la producción mediante fermentación de sustancias derivadas de purinas, tales como nucleósidos purina y/o nucleótidos purina, y proporcionar un procedimiento para producir sustancias derivadas de purina utilizando dicha bacteria.

Medios para alcanzar el objetivo En el contexto de la presente invención se han llevado a cabo diversas investigaciones con el fin de alcanzar el objetivo anteriormente indicado. En consecuencia, se ha descubierto que, al reducir la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa de la ruta de la gluconeogénesis en una bacteria Bacillus, se mejora la capacidad de la bacteria 50 de producir un nucleósido de purina o un nucleótido pura, y han llevado a cabo la presente invención.

De esta manera, la presente memoria da a conocer lo siguiente.

(1) Una bacteria perteneciente al género Bacillus que presenta la capacidad de producir sustancias derivadas de 55 purinas, en la que la bacteria ha sido modificada de manera que se ha reducido la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa.

(2) La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, en la que la sustancia derivada de purina es un nucleósido de purina seleccionado de entre el grupo que consiste en inosina, xantosina, 60 guanosina y adenosina.

(3) La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, en la que la sustancia derivada de purina es un nucleótido de purina seleccionado de entre el grupo que consiste de ácido inosínico, ácido xantílico, ácido guanílico y ácido adenílico. 65

(4) La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, en la que se ha reducido la actividad de fructosa bisfosfatasa mediante la interrupción de un gen codificante de la fructosa bisfosfatasa.

(5) La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, en la que el gen codificante de la fructosa bisfosfatasa es un gen codificante de una de las proteínas (A) o (B) siguientes:

(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1,

(B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de uno o varios residuos aminoácidos y presenta actividad de fructosa bisfosfatasa.

(6) La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, que ha sido modificada adicionalmente de manera que se incrementa la actividad de la fosforibosil pirofosfato sintetasa.

(7) La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, que se ha modificado adicionalmente de manera que se incremente la cantidad de expresión del operón de purina.

(8) La bacteria perteneciente al género Bacillus tal como se ha indicado anteriormente, en la que la cantidad de expresión del operón de purina se incrementa mediante la interrupción del gen purR, que es un gen codificante... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Procedimiento para producir una sustancia derivada de purina, que comprende:

en el que la bacteria ha sido modificada de manera que la actividad enzimática de la fructosa bisfosfatasa se reduce en comparación con una cepa no modificada mediante la alteración de un gen codificante de fructosa bisfosfatasa, o reduciendo la cantidad de expresión del gen codificante de fructosa bisfosfatasa,

en el que el gen codificante de fructosa bisfosfatasa es un gen codificante de una proteína de (A) o (B) siguientes:

(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2,

(B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 10 residuos aminoácidos y presenta actividad de fructosa bisfosfatasa, y

en el que la sustancia derivada de purina es un nucleósido de purina seleccionado de entre el grupo que consiste en inosina, xantosina, guanosina y adenosina o un nucleótido de purina seleccionado de entre el grupo que consiste en ácido inosínico, ácido xantílico, ácido guanílico y ácido adenílico.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la bacteria ha sido modificada adicionalmente de manera que se incrementa la actividad de fosforibosil pirofosfato sintetasa en comparación con una cepa no modificada mediante el incremento de la expresión de un gen codificante de la fosforibosil pirofosfato sintetasa en la bacteria mediante la utilización de un plásmido que contiene el gen o integrando el gen en el cromosoma de la bacteria, y en el que el gen codificante de fosforibosil pirofosfato sintetasa es un gen codificante de una proteína de (A) o (B) siguientes:

(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 4,

(B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 4 que incluye sustituciones,

deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 10 residuos aminoácidos y presenta actividad de fosforibosil pirofosfato sintetasa.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la bacteria ha sido modificada adicionalmente de manera que se incrementa la cantidad de expresión del operón purina en comparación con una cepa no modificada mediante el incremento de la expresión de genes del operón purina en la bacteria mediante un procedimiento de utilización de un plásmido que contiene los genes o integración de los genes en el cromosoma de la bacteria, mediante la sustitución del promotor nativo del operón purina por un promotor más fuerte, mediante la sustitución de la región -35 o -10 del promotor nativo del operón purina por una secuencia de consenso, mediante la interrupción de un gen codificante de un represor de purina, mediante la reducción de la cantidad de expresión del gen 45 codificante del represor de purina, o mediante la deleción de la secuencia atenuadora del operón purina, y

en el que el gen codificante del represor de purina es un gen codificante de una proteína de las (A) o (B) siguientes:

(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 6,

(B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 6 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 10 residuos aminoácidos y que presenta actividad de represor de purina.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la bacteria ha sido modificada adicionalmente de manera que se reduzca la actividad de purina nucleósido fosforilasa en comparación con una cepa no modificada mediante la interrupción de un gen codificante de purina nucleósido fosforilasa o mediante la reducción de la cantidad de expresión del gen codificante de purina nucleósido fosforilasa, y en el que el gen codificante de purina nucleósido fosforilasa es un gen codificante de una proteína de las (A) o (B) siguientes:

(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 8 o nº 10,

(B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 8 o nº 10 que incluye sustituciones,

deleciones, inserciones, adiciones o inserciones de 1 a 10 residuos aminoácidos y que presenta actividad de 65 purina nucleósido fosforilasa.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la bacteria ha sido modificada adicionalmente de manera que se reduzca la actividad de IMP deshidrogenasa en comparación con una cepa no modificada mediante la reducción de la cantidad de expresión del gen codificante de la IMP deshidrogenasa, y en el que el gen codificante de la IMP deshidrogenasa es un gen codificante de una proteína de las (A) o (B) siguientes:

(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 14,

(B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 14 que incluye sustituciones,

deleciones, inserciones, adiciones o inversiones de 1 a 10 residuos aminoácidos y que presenta actividad de 10 IMP deshidrogenasa.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la bacteria es Bacillus subtilis.

7. Procedimiento para producir un nucleótido de purina, que comprende:

producir un nucleósido de purina mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,

hacer reaccionar el nucleósido de purina con un donante de fosfatos seleccionado de entre el grupo que consiste en ácido polifosfórico, fosfato de fenilo y fosfato de carbamilo, y un microorganismo que presenta una capacidad 20 de producir un éster de ácido nucleósido-5’-fosfórico o fosfatasa ácida con el fin de producir un nucleótido de purina, y

recoger el nucleótido de purina.

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