Armazones de proteína para miméticos de anticuerpo y otras proteínas de unión.

Una proteína similar a anticuerpo que comprende un décimo dominio de fibronectina de tipo III ( 10 Fn3),

en la que la secuencia de aminoácidos de cada uno del bucle BC, el bucle DE y el bucle FG comprende una o más alteraciones de aminoácidos respecto a la secuencia del décimo dominio de fibronectina de tipo III humano de origen natural, estando caracterizada dicha proteína por su capacidad de unirse a antígeno.

Armazones de proteína para miméticos de anticuerpo y otras proteínas de unión Antecedentes de la invención La presente se refiere a armazones proteicos útiles, por ejemplo, para la generación de productos que tienen características de unión novedosas.

Las proteínas que tienen estructuras tridimensionales relativamente definidas, designadas normalmente como armazones proteicos, pueden usarse como reactivos para el diseño de productos modificados por ingeniería genética. Estos armazones contienen típicamente una o más regiones que son susceptibles de variación de secuencia específica o aleatoria, y dicha aleatorización de secuencia se lleva a cabo a menudo para producir colecciones de proteínas de las que pueden seleccionarse los productos deseados. Un área particular en la que sonútiles dichos armazones es en el campo del diseño de anticuerpos.

Se han intentado una serie de enfoques anteriores para la manipulación del sistema inmunitario de mamíferos para obtener reactivos o medicamentos. Estos han incluido inyectar a animales antígenos de interés para obtener mezclas de anticuerpos policlonales reactivos frente a antígenos específicos, la producción de anticuerposmonoclonales en cultivo celular de hibridoma (Koehler y Milstein, Nature 256: 495, 1975) , la modificación de anticuerpos monoclonales existentes para obtener propiedades de reconocimiento nuevas u optimizadas, la creaciónde fragmentos de anticuerpo novedosos con características de unión deseables y la aleatorización de anticuerpos monocatenarios (creados conectando las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de moléculas deanticuerpo con un engarce peptídico flexible) , seguido de selección de la unión a antígeno mediante exposición en fago (Clackson et al., Nature 352: 624, 1991) .

Además, se han propuesto varios armazones proteicos no de inmunoglobulina para obtener proteínas con propiedades de unión novedosas. Por ejemplo, se ha diseñado un armazón de “minicuerpo”, que está relacionado con el plegamiento de inmunoglobulina, eliminando tres cadenas beta de un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo monoclonal (Tramontano et al., J. Mol. Recognit. 7: 9, 1994) . Esta proteína incluye 61 residuos ypuede usarse para presentar dos bucles hipervariables. Estos dos bucles se han aleatorizado y los productos se han seleccionado por unión a antígeno, pero hasta ahora la estructura parece tener una utilidad algo limitada debido aproblemas de solubilidad. Otra estructura usada para exponer bucles ha sido el tendamistato, un sándwich deláminas beta de 6 cadenas de 74 residuos mantenidas juntas por dos enlaces disulfuro (McConnell y Hoess, J. Mol. Biol. 250: 460, 1995) . Este armazón incluye tres bucles pero, hasta la fecha, sólo se ha examinado en dos de estos bucles el potencial de aleatorización.

Se han ensayado otras proteínas como marcos estructurales y se han usado para exponer residuos aleatorizados en superficies de hélice alfa (Nord et al., Nat. Biotechnol. 15: 772, 1997; Nord et al., Protein Eng. 8: 601, 1995) , bucles entre hélices alfa en haces de hélices alfa (Ku y Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6552, 1995) y bucles limitados por puentes disulfuro, tales como aquellos de inhibidores de proteasa pequeños (Markland et al., Biochemistr y 35: 8045, 1996; Markland et al., Biochemistr y 35: 8058, 1996; Rottgen y Collins, Gene 164: 243, 1995; Wang et al., J. Biol. Chem. 270: 12250, 1995) .

Sumario de la invención La invención se refiere a la materia objeto expuesta en las reivindicaciones.

La presente invención proporciona una nueva familia de proteínas capaces de evolucionar para unirse a cualquier compuesto de interés. Estas proteínas, que hacen uso de una fibronectina o armazón similar a fibronectina, funcionan de manera característica de los anticuerpos naturales o modificados por ingeniería genética (es decir, anticuerpos policlonales, monoclonales o monocatenarios) y, además, poseen ventajas estructurales. Específicamente, la estructura de estos miméticos de anticuerpo se ha diseñado para un plegamiento, estabilidad y solubilidad óptimos, incluso en condiciones que normalmente conducen a la pérdida de estructura y función en anticuerpos.

Estos miméticos de anticuerpo pueden utilizarse con el fin de diseñar proteínas que sean capaces de unirse virtualmente a cualquier compuesto (por ejemplo, cualquier proteína) de interés. En particular, las moléculas basadas en fibronectina descritas en la presente memoria pueden usarse como armazones que se someten a una evolución dirigida diseñada para aleatorizar uno o más de los tres bucles de fibronectina que son análogos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una región variable de anticuerpo. Dicho enfoque de evolución dirigida da como resultado la producción de moléculas similares a anticuerpo con altas afinidades por los antígenos de interés. Además, los armazones descritos en la presente memoria pueden usarse para exponer bucles expuestos definidos (por ejemplo, bucles previamente aleatorizados y seleccionados basándose en la unión a antígeno) para dirigir la evolución de moléculas que se unen a dichos bucles introducidos. Puede llevarse a cabo una selección de este tipo para identificar a moléculas de reconocimiento de cualquier bucle similar a CDR individualo, como alternativa, para el reconocimiento de dos o los tres bucles similares a CDR combinados en un epítopo nolineal.

En consecuencia, la presente invención se refiere a una proteína similar a anticuerpo que comprende un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3) en el que la secuencia de aminoácidos de al menos un bucle seleccionado del grupo que consiste en el bucle BC, el bucle DE y el bucle FG comprende una más alteraciones de aminoácidos respecto a la secuencia de un décimo dominio de fibronectina de tipo III humano de origen natural, estando caracterizada dicha proteína por su capacidad de unirse a un antígeno. Más específicamente, la presente invenciónse refiere a una proteína similar a anticuerpo que comprende un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3) enel que la secuencia de aminoácidos de cada uno del bucle BC, el bucle DE y el bucle FG comprende una o más alteraciones de aminoácidos respecto a la secuencia de un décimo dominio de fibronectina de tipo III humano de origen natural, estando caracterizada dicha proteína por su capacidad de unirse a un antígeno.

Las proteínas de la invención se caracterizan por su capacidad de unirse a un compuesto que no se une a lafibronectina correspondiente de origen natural.

En dichas proteínas, la unión a compuesto está preferentemente mediada por uno, dos o los tres bucles de 10Fn3. 5 En otras realizaciones preferidas, el segundo bucle de 10Fn3 puede extenderse en longitud respecto al módulo de origen natural.

En consecuencia, la presente invención se refiere también a una proteína similar a anticuerpo que comprende un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3) en el que la secuencia de aminoácidos de al menos un bucle seleccionado del grupo que consiste en el bucle BC, el bucle DE y el bucle FG comprende una más alteraciones de aminoácidos respecto a la secuencia de un décimo dominio de fibronectina de tipo III humano de origen natural, y en la que el bucle DE de dicho 10Fn3 se extiende en longitud respecto del 10Fn3 humano de origen natural, estando caracterizada dicha proteína por su capacidad de unirse a un antígeno.

En otras realizaciones preferidas, el 10Fn3 puede carecer de un motivo de unión a integrina. En estas moléculas, elmotivo de unión a integrina puede reemplazarse por una secuencia de aminoácidos en la que una secuencia de aminoácido básico-aminoácido neutro-aminoácido ácido (en la dirección N-terminal a C-terminal) reemplaza al motivo de unión a integrina; es una secuencia preferida la serina-glicina-glutamato. Particularmente, si carecen deun dominio de unión a integrina, las proteínas de la invención pueden formularse en un vehículo fisiológicamente aceptable. En otra realización preferida, las proteínas de la invención carecen de puentes disulfuro.

Cualquiera de las proteínas descritas en la presente memoria puede formularse como parte de una proteína de

fusión (por ejemplo, una proteína de fusión que incluye adicionalmente un dominio Fc de inmunoglobulina, una proteína de complemento, una proteína toxina o una proteína albúmina) .

En consecuencia, la presente invención se refiere también a una proteína de fusión que comprende un dominio Fcde inmunoglobulina, una proteína de complemento, una proteína toxina o una proteína albúmina y una proteína similar a anticuerpo que comprende un décimo dominio de... [Seguir leyendo]

1. Una proteína similar a anticuerpo que comprende un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3) , en laque la secuencia de aminoácidos de cada uno del bucle BC, el bucle DE y el bucle FG comprende una o másalteraciones de aminoácidos respecto a la secuencia del décimo dominio de fibronectina de tipo III humano de origen natural, en el que la secuencia de aminoácidos del 10Fn3 humano de origen natural se expone en la figura 4, el bucle BC del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

2. 31 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4, el bucle DE del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

5. 56 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4 y el bucle FG del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

7. 88 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4, estando caracterizada dicha proteína por su capacidad de unirse a antígeno.

2. Una proteína similar a anticuerpo que comprende un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3) , en laque la secuencia de aminoácidos de al menos un bucle seleccionado del grupo que consiste en el bucle BC, el bucle DE y el bucle FG comprende una o más alteraciones de aminoácidos respecto a la secuencia del décimo dominio de fibronectina de tipo III humano de origen natural, en la que la secuencia de aminoácidos del 10Fn3 humano de origen natural se expone en la figura 4, el bucle BC del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

2. 31 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4, el bucle DE del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

5. 56 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4 y el bucle FG del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

7. 88 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4 y en la que l bulce DE de dicho 10Fn3 está extendido en longitud respecto al 10Fn3 humano de origen natural, estando caracterizada dicha proteína por su capacidad de unirse a antígeno.

3. La proteína de la reivindicación 1, en la que el bucle DE de dicho 10Fn3 se extiende en longitud respecto al10Fn3 humano de origen natural.

4. La proteína de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha unión a antígeno está mediada por tres bucles de 10Fn3.

5. La proteína de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho 10Fn3 carece de un motivo de unión a integrina.

6. La proteína de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha proteína carece de enlaces disulfuro.

7. La proteína de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha proteína está unida covalentemente a un ácido nucleico.

8. La proteína de la reivindicación 7, en la que dicho ácido nucleico codifica dicha proteína.

9. La proteína de la reivindicación 8, en la que dicho ácido nucleico es ARN.

10. Una proteína de fusión que comprende un ácido nucleico unido covalentemente a una proteína similar aanticuerpo que comprende un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3) , en la que la secuencia de aminoácidos de al menos un bucle seleccionado del grupo que consiste en el bucle BC, el bucle DE y el bucle FGcomprende una o más alteraciones de aminoácidos respecto a la secuencia de un décimo dominio de fibronectina

de tipo III humano de origen natural, en el que la secuencia de aminoácidos del 10Fn3 de origen natural se expone en la figura 4, el bucle BC del 10Fn3 de origen natural está entre los residuo.

2. 31 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4, el bucle DE del 10Fn3 de origen natural está entre los residuo.

5. 56 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4 y el bucle FG del 10Fn3 de origen natural está entre los residuos 7688 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4, estando caracterizada dicha proteína por su capacidad de unirse a un antígeno.

11. Una proteína de fusión que comprende la proteína de la reivindicación 1 ó 2.

12. La proteína de fusión de la reivindicación 11, en la que dicha proteína de fusión comprende además un dominio Fc de inmunoglobulina, una proteína del complemento, una proteína toxina o una proteína albúmina.

13. Una proteína de fusión que comprende un dominio Fc de inmunoglobulina, una proteína de complemento,

una proteína toxina o una proteína albúmina y una proteína similar a anticuerpo que comprende un décimo dominiode fibronectina de tipo III (10Fn3) , en la que la secuencia de aminoácidos de al menos un bucle seleccionado del grupo que consiste en el bucle BC, el bucle DE y el bucle FG comprende una o más alteraciones de aminoácidosrespecto a la secuencia de un décimo dominio de fibronectina de tipo III humano de origen natural, en el que la secuencia de aminoácidos del 10Fn3 humano de origen natural se expone en la figura 4, el bucle BC del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

2. 31 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4, el bucle DE del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

5. 56 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4 y el bucle FG del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

7. 88 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4, estando caracterizada dicha proteína por su capacidad de unirse a un antígeno.

14. Un dímero o multímero de una proteína similar a anticuerpo, en el que la proteína similar a anticuerpo comprende un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3) en el que la secuencia de aminoácidos de al menos un bucle seleccionado del grupo que consiste en el bucle BC, el bucle DE y el bucle FG comprenden una o másalteraciones de aminoácidos respecto a la secuencia de un décimo dominio de fibronectina de tipo III humano deorigen natural, en el que la secuencia de aminoácidos del 10Fn3 humano de origen natural se expone en la figura 4, el bucle BC del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

2. 31 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4, el bucle DE del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

5. 56 deaminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4 y el bucle FG del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

7. 88 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4, estando caracterizada dicha proteína por su capacidad de unirse a un antígeno.

15. La proteína de la reivindicación 14, en la que dos o más de dos 10Fn3 están unidos covalentemente entre sí.

16. La proteína de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho antígeno es una proteína.

17. Una composición que comprende la proteína de la reivindicación 1 ó 2 y un vehículo fisiológicamente 5 aceptable.

18. Una proteína de la reivindicación 1 ó 2 para su uso en terapia o diagnóstico.

19. Un ácido nucleico que codifica la proteína de la reivindicación 1 ó 2.

20. El ácido nucleico de la reivindicación 19, en el que dicho ácido nucleico es ADN o ARN.

21. Un procedimiento para obtener una proteína similar a anticuerpo de la reivindicación 1, comprendiendo 10 dicho procedimiento:

(a) aleatorizar el bucle BC, el bucle DE y el bucle FG de un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3) , creando así una biblioteca de proteínas que comprenden un décimo dominio de fibronectina de tipo III en elque la secuencia de aminoácidos de cada uno de los bucles comprende una o más alteraciones de aminoácidosrespecto a la secuencia de un décimo dominio de fibronectina de tipo III humano de origen natural, en el que la secuencia de aminoácidos del 10Fn3 humano de origen natural se expone en la figura 4, el bucle BC del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

2. 31 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4, el bucle DE del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

5. 56 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4 y el bucle FG del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

7. 88 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4;

(b) poner en contacto un antígeno con las proteínas, llevándose a cabo dicho contacto en condicionesque permitan la formación de complejo de antígeno-proteína;

(c) seleccionar un complejo de antígeno-proteína; y

(d) obtener, a partir de dicho complejo, dicha proteína que se une a dicho antígeno.

22. Un procedimiento para obtener una proteína similar a anticuerpo de la reivindicación 2, comprendiendo 25 dicho procedimiento:

(a) aleatorizar al menos un bucle seleccionado del grupo que consiste en el bucle BC, el bucle DE y el bucle FG y extender el bucle DE en longitud de un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3) , creando así una biblioteca de proteínas que comprenden un décimo dominio de fibronectina de tipo III en el que la secuencia de aminoácidos del bucle comprende una o más alteraciones de aminoácidos respecto a la secuencia de un décimo dominio de fibronectina de tipo III humano de origen natural, en el que la secuencia de aminoácidos del 10Fn3 humano de origen natural se expone en la figura 4, el bucle BC del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

2. 31 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4, el bucle DE del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

5. 56 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4 y el bucle FG del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

7. 88 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4 y en el que el bucle DE de dicho 10Fn3 está extendido en longitud respecto al 10Fn3 de origen natural;

(b) poner en contacto un antígeno con las proteínas, llevándose a cabo dicho contacto en condiciones que permitan la formación de complejo de antígeno-proteína;

(c) seleccionar un complejo de antígeno-proteína; y

(d) obtener, a partir de dicho complejo, dicha proteína que se une a dicho antígeno.

23. Un procedimiento para obtener una proteína similar a anticuerpo que se une a un antígeno, comprendiendodicho procedimiento:

(a) aleatorizar al menos un bucle seleccionado del grupo que consiste en el bucle BC, el bucle DE y el bucle FG de un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3) , creando así una biblioteca de proteínas que 45 comprenden un décimo dominio de fibronectina de tipo III en el que la secuencia de aminoácidos del bucle comprende una o más alteraciones de aminoácidos respecto a la secuencia de un décimo dominio de fibronectina de tipo III humano de origen natural, en el que la secuencia de aminoácidos del 10Fn3 humano de origen natural se expone en la figura 4, el bucle BC del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

2. 31 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4, el bucle DE del 10Fn3 humano de origen natural está entre los 50 residuo.

5. 56 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4 y el bucle FG del 10Fn3 humano de origen natural está entre los residuo.

7. 88 de aminoácidos de la secuencia como se expone en la figura 4, en elque cada proteína está unida covalentemente a un ácido nucleico que codifica la proteína;

(b) poner en contacto dicho antígeno con las proteínas, llevándose a cabo dicho contacto encondiciones que permitan la formación de complejo de antígeno-proteína;

(c) seleccionar un complejo de antígeno-proteína; y

(d) obtener, a partir de dicho complejo, dicha proteína que se une a dicho antígeno.

24. El procedimiento de las reivindicaciones 21, 22 ó 23, comprendiendo adicionalmente dicho procedimiento aleatorizar al menos un bucle de dicha proteína obtenida en la etapa (d) y repetir dichas etapas (b) , (c) y (d) usando dicha proteína aleatorizada adicionalmente.

25. Un procedimiento para obtener un compuesto que se une a una proteína de la reivindicación 1 ó 2, 5 comprendiendo dicho procedimiento:

(a) poner en contacto dicha proteína con un compuesto candidato, llevándose a cabo dicho contacto en condiciones que permitan la formación de complejo de compuesto-proteína; y

(b) obtener, a partir de dicho complejo, dicho compuesto que se une a dicha proteína.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, comprendiendo dicho procedimiento adicionalmente modificar

dicho compuesto obtenido en la etapa (b) y repetir dichas etapas (a) y (b) usando dicho compuesto modificado adicionalmente.

27. El procedimiento de las reivindicaciones 21, 22, 23 ó 24, en el que dicho antígeno o compuesto es una proteína.

28. El procedimiento de las reivindicaciones 21, 22 ó 23, en el que dicho antígeno está inovilizado sobre un15 soporte sólido.