Aptámeros con uridinas 5-(N-naftil)-sustituidas.
Un aptámero oligonucleótido que comprende al menos un nucleótido de uridina de base modificada,
teniendo el nucleótido de uridina de base modificada la siguiente estructura:**Fórmula**
y Z ≥ R más grupo conector (CH2)n, donde n ≥ 1, 2 o 3, y**Fórmula**
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12160299.
Solicitante: Somalogic, Inc.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 2945 Wilderness Place Boulder, CO 80301 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: GOLD, LARRY, EATON, BRUCE, SCHNEIDER,DANIEL J, ZICHI,DOMINIC, WILCOX,SHERI K, BOCK,CHRIS.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
PDF original: ES-2533711_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Aptámeros con uridinas 5-(N-naftil)-sustituidas Campo de la invención
La presente divulgación se refiere, en general, a métodos para la generación de aptámeros y fotoaptámeros que tienen propiedades mejoradas y a los aptámeros y fotoaptámeros mejorados generados de este modo. En particular, la presente divulgación describe aptámeros de velocidad de disociación baja que son muy específicos de una diana de interés. La divulgación describe la composición de estos aptámeros de velocidad de disociación lenta, así como métodos para su selección. Adicionalmente, la divulgación describe construcciones de aptámeros con funcionalidades mejoradas para métodos de detección. Adicionalmente, la divulgación describe aplicaciones posibilitadas por estos aptámeros mejorados.
Antecedentes
La siguiente descripción proporciona un resumen de la información relevante a la presente divulgación y no es una concesión de que cualquier información proporcionada o publicaciones citadas en el presente documento sea técnica anterior de la invención reivindicada.
El proceso SELEX es un método para la selección in vitro de moléculas de ácido nucleico que pueden unirse con una especificidad elevada a las moléculas diana y se describe en la patente de EE.UU. N2 5.475.096 titulada "Nucleic Acid Ligands" y la patente de EE.UU. N2 5.270.163 (véase también el documento WO 91/19813) titulada "Nucleic Acid Ligands". Estas patentes, en conjunto citadas en el presente documento patentes SELEX, describen métodos para fabricar un aptámero para cualquier molécula diana deseada.
El proceso SELEX básico se ha modificado para alcanzar un número de objetivos específicos. Por ejemplo, la patente de EE.UU. N2 5.707.796, titulada "Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure," describe el uso del proceso SELEX junto con electroforesis en gel para seleccionar moléculas de ácido nucleico con características estructurales, tales como AND doblado. La patente de EE.UU. N2 5.580.737, titulada "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discrimínate Between Theophylline and Caffeine," describe un método para identificar aptámeros altamente específicos capaces de discrimina entre moléculas estrechamente relacionadas, denominado Counter-SELEX. La patente de EE.UU. N2 5.567.588, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solutlon SELEX," describe un método basado en SELEX que alcanza un reparto altamente eficiente entre oligonucleótidos que tienen una afinidad alta y baja por una molécula diana. La patente de EE.UU. N2 5.496.938, titulada "Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev," describe métodos para obtener aptámeros mejorados después de realizar un SELEX. La patente de EE.UU. N2 5.705.337, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX," describe métodos para la unión covalente de un aptámero a su diana.
El proceso SELEX abarca la identificación de aptámeros de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al ligando, tal como características de estabilidad in vivo mejorada o de liberación mejorada. Ejemplos de dichas modificaciones incluyen sustituciones químicas en las posiciones de la ribosa y/o el fosfato y/o la base. Aptámeros identificados por el proceso SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en la patente de EE.UU. N2 5.660.985, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleoides," que describe oligonucleótidos que contienen derivados nucleotídicos modificados químicamente en las posiciones 5'- y 2'-de las pirimidinas. La patente de EE.UU. N2 5.580.737, véase anteriormente, describe aptámeros altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino (2'-NH2), 2'-fluoro (2'-F), y/o 2'-0-metilo (2'-OMe).
Otras modificaciones del proceso SELEX se describen en la patente de EE.UU. N2 5.763.177, la patente de EE.UU. N2 6.001.577 y la patente de EE.UU. N2 6.291.184, cada una de las cuales se titula "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX; " véase también, por ejemplo, la patente de EE.UU. N2 6.458.539 titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands". Estas patentes, en conjunto denominadas en el presente documento las patentes de PhotoSELEX describe varios métodos SELEX para seleccionar aptámeros que contienen grupos funcionales fotorreactivos capaces de unirse y/o fotorreticular y/o fotoinactivar una molécula diana. Los aptámeros fotorreactivos resultantes se denominan aptámeros fotorreticulantes o fotoaptámeros.
Aunque estos procesos SELEX y photoSELEX son útiles, siempre existe la necesidad de procesos que conduzcan a propiedades mejoradas de aptámeros generados con técnicas de selección in vitro. Por ejemplo, existe la necesidad de aptámeros para las moléculas diana con afinidades de unión mejores que los obtenidos con los nucleótidos ADN o ARN de origen natural, así como métodos para producir dichos aptámeros. Para muchas aplicaciones, tal como, por ejemplo, ensayos in vitro, aplicaciones diagnósticas, terapéuticas o de imagen, es de interés producir aptámeros con velocidades de disociación lentas del complejo de afinidad aptámero/diana. Se han propuesto varias técnicas para producir dichos reactivos (véanse, por ejemplo, los documentos W099/27133 y US2005/0003362). No
obstante, estos procesos de selección no discriminan entre la selección de reactivos que tienen cinéticas de asociación rápida con la diana (es decir, velocidades de asociación rápidas) y la selección de reactivos que tienen cinéticas de disociación lentas con la diana (es decir, velocidades de disociación lentas). Por tanto, existe la necesidad de nuevos procesos y técnicas que favorezcan la selección de aptámeros de velocidad de disociación lenta al tiempo que inhiban la selección de aptámeros que simplemente tengan una velocidad de asociación rápida con la diana.
Latham et al. (Nucleic Acids Research Special Publication (1994), 22(14):2817-2822) divulgan aptámeros que se pueden obtener mediante procedimientos SELEX que incorporan pirimidinas modificadas en su posición 5, es decir 5-(1 -pentinil)-2'-deoxiuridina.
Por último, existe la necesidad de construcciones de aptámeros que incluyen diferentes funcionalidades integradas. Estas funcionalidades pueden incluir marcadores de inmovilización, marcadores de detección, medios para estimular o controlar la separación etc.
Sumario
La presente divulgación describe nuevos aptámeros y métodos para producir y usar dichos aptámeros. En particular, la divulgación describe aptámeros de velocidades de disociación lentas (velocidad de disociación lenta), aptámeros de velocidad de disociación lenta que contienen pirimidinas modificadas en C-5 y procesos para la selección de aptámeros de velocidad de disociación lenta mediante dilución, mediante la adición de un competidor o mediante una combinación de ambos abordajes. Además se describen aptámeros de velocidad de disociación lenta a varias dianas tales como proteínas y péptidos. También se describen aptámeros de velocidad de disociación lenta con características estructurales y temperaturas de fusión únicas. La divulgación también describe aptámeros de velocidad de disociación lenta con grupos funcionales fotorreactivos, aptámeros que son resistentes a la presencia de materiales polianiónicos y un proceso de selección para estos aptámeros, así como aptámeros construidos con otras diversas funcionalidades para mejorar su utilidad en varias aplicaciones.
La presente divulgación describe métodos SELEX mejorados para generar aptámeros que son capaces de unirse a moléculas diana. Más específicamente, la presente divulgación describe métodos para producir aptámeros y/o fotoaptámeros que tienen velocidades de disociación más lentas de sus respectivas moléculas diana que los aptámeros y/o fotoaptámeros obtenidos con los métodos SELEX anteriores. En general, después de poner en contacto la mezcla candidata con la molécula diana y permitir la formación de complejos de ácido nucleico-diana, se introduce un proceso de enriquecimiento a velocidad de disociación lenta en el que los complejos ácido nucleico- diana con velocidades de disociación rápidas se disociarán y no se volverán a formar, mientras que los complejos con velocidades de disociación lentas permanecerán intactos. Los métodos para introducir un proceso de enriquecimiento a velocidad de disociación lenta incluyen, entre otros, añadir moléculas competidoras a la mezcla de ácidos nucleicos y moléculas diana, diluir la mezcla de ácidos nucleicos y moléculas diana o una combinación de ambos.... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un aptámero oligonucleótido que comprende al menos un nucleótido de uridina de base modificada, teniendo el nucleótido de uridina de base modificada la siguiente estructura:
7 A
donde X= üaae
*
R=
2. El aptámero de la reivindicación 1, en el que n=1.
3. El aptámero de las reivindicaciones 1 o 2 en donde el aptámero comprende al menos dos de dichos nucleótidos de uridina de base modificada.
4. El aptámero de las reivindicaciones 1 o 2 en donde el aptámero comprende al menos tres de dichos nucleótidos de uridina de base modificada.
5. El aptámero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el aptámero tiene una velocidad de disociación (ti/2) de un complejo de aptámero-diana no covalente superior o igual a aproximadamente 30 minutos.
6. Un complejo no covalente de un aptámero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y una molécula diana.
7. Un complejo no covalente de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la velocidad de disociación (ti/2) del aptámero de la molécula diana es superior o igual a 30 minutos.
8. Un complejo no covalente de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7 en el que la molécula diana es una proteína.
9. Un complejo no covalente de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7 en el que la molécula diana es una proteína seleccionada de la FIG 7.
10. El aptámero o complejo no covalente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la velocidad de disociación (ti/2) del aptámero de un complejo de aptámero-diana no covalente está entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 240 minutos; de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 60 minutos; de aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 90 minutos; de aproximadamente 90 minutos a aproximadamente 120 minutos; de aproximadamente 120 minutos a aproximadamente 150 minutos; de aproximadamente 150 minutos a aproximadamente 180 minutos; de aproximadamente 180 minutos a aproximadamente 210 minutos; o de aproximadamente 210 minutos a aproximadamente 240 minutos.
11. Un kit de diagnóstico que contiene un aptámero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
**(Ver fórmula)**O
^T^a
N O
O
u
y Z = R más grupo conector (CH2K donde n = 1,2 o 3, y
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