APARATO Y METODO PARA MONITORIZAR CULTIVOS.

Un dispositivo exclusor de burbujas adaptado para uso con, y unido a,

una sonda para la medición continua de la densidad celular de un cultivo en un medio líquido en un fermentador aireado, comprendiendo el dispositivo exclusor de burbujas una entrada y una salida para permitir el flujo de líquido a través del dispositivo, teniendo la entrada un conducto que, en uso, es sustancialmente vertical, comprendiendo el conducto un medio de exclusión de burbujas que crea una trayectoria de flujo en serpentín dentro del conducto, sirviendo el medio de exclusión de burbujas para reducir o evitar el ingreso de burbujas desde el medio líquido fuera del dispositivo

Aparato y método para monitorizar cultivos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un aparato para, y a un método para, la monitorización continua de la densidad celular de un cultivo celular en un fermentador aireado.

Antecedentes de la invención

El proceso de fermentación aerobia proporciona un mecanismo importante para la formación de ciertos productos, tales como enzimas, antibióticos, agentes de diagnóstico y terapéuticos. Tales productos se producen típicamente mediante la sobreexpresión de una proteína en células de un microorganismo, tal como E. coli o S. cerevisiae.

A escala de laboratorio, tales sustancias de interés se producen típicamente preparando un fermento, el cual se usa entonces para inocular un volumen más grande de medio de cultivo. Típicamente, el medio de cultivo está contenido en un matraz cónico, y se coloca en una incubadora a una temperatura deseada. El crecimiento de células en el medio de cultivo se monitoriza mediante la toma intermitente de muestras de pequeñas cantidades del cultivo y midiendo la densidad óptica del medio de cultivo con el uso de un espectrofotómetro externo. A título de explicación, la medida de la densidad óptica a aproximadamente 600 nm detecta la dispersión de la luz por microorganismos, y la lectura de la OD resultante es proporcional a la densidad celular. Las células crecen y se dividen, y, típicamente, cuando la densidad óptica del cultivo ha alcanzado un valor deseado, se induce la sobreexpresión de una proteína de interés, por ejemplo mediante un cambio en la temperatura o la adición de un inductor, etc.

La fermentación aerobia se lleva a cabo de forma habitual a escala industrial en tanques agitados. Típicamente, se usa una sonda óptica para medir la densidad óptica del medio de cultivo según la ley de Beer Lambert, que se define mediante la siguiente ecuación:

OD = E.L. log₁₀ (I₀/I)

en la que

E = Coeficiente de extinción;

L = Longitud de la trayectoria de la celda;

I₀ = Intensidad de la luz incidente;

I = Intensidad de la luz transmitida.

En fermentaciones a escala industrial, normalmente se requiere una agitación vigorosa y aireación a fin de mantener el crecimiento óptimo de los microorganismos o células debido a que necesitan respirar. En tales condiciones, tanto como un quinto del volumen líquido aireado global del medio de cultivo puede comprender burbujas de gas dispersas en el líquido. Un buen mezclamiento del líquido del medio aireado significa que muchas de estas burbujas de gas son suficientemente pequeñas para pasar a través del recorrido de la luz de la sonda óptica usada para medir la densidad celular del cultivo. La presencia de burbujas de gas en el medio de cultivo puede tener un efecto sobre la densidad celular aparente del medio, debido a que las burbujas de gas tienen diferentes propiedades dispersoras de la luz en comparación con el medio de cultivo y las células suspendidas en él. La dispersión de la luz por las burbujas en el medio tiende a provocar una sobreestimación de la densidad óptica aparente del medio. En particular, a bajas densidades celulares (en las que la relación de burbujas de gas a células es la más grande), la naturaleza al azar del tamaño y concentración de las burbujas de gas en el punto de medida en el tanque agitado da como resultado "ruido", que se muestra como dispersión de datos en las medidas de densidad celular. Para algunas aplicaciones, tales como el marcado de fluorescencia, esto es un problema, puesto que en tales casos es necesario detectar cambios muy pequeños en la absorbancia, a valores que están más allá del nivel estándar de precisión. Además, la velocidad de aireación y agitación pueden variar durante la fermentación, de forma que el efecto de las burbujas sobre las medidas realizadas también es variable.

Aunque se pueden usar otros métodos para monitorizar el crecimiento de microorganismos durante la fermentación aerobia (tales como la medida de la velocidad de producción de dióxido de carbono, la velocidad de consumo de oxígeno, o la fluorescencia), el método preferido implica la medición de la densidad celular de un cultivo debido a que es menos sensible a las condiciones del cultivo, tales como temperatura y pH. En la mayoría de los casos, la medida de la densidad óptica del cultivo se lleva a cabo "fuera de línea", usando un espectofotómetro, típicamente en la región de 600 nm. A título de explicación, la medición "fuera de línea" de la densidad óptica de un cultivo implica retirar una muestra del medio y medir la densidad óptica de la muestra usando un espectofotómetro externo. Sin embargo, tal medición "fuera de línea" tiene típicamente las desventajas de que puede incrementar el tiempo, coste y pérdida de volumen del cultivo, y también incrementa el riesgo de contaminación del fermentador. Además, usando métodos convencionales, la densidad celular de un cultivo sólo se puede medir directamente de forma exacta para valores por debajo de 0,8, preferiblemente por debajo de 0,7 unidades de densidad óptica (OD). Esto es debido al hecho de que, por encima de estos valores, la relación entre la densidad celular y la densidad óptica ya no es lineal. A fin de medir valores de OD por encima de 0,7-0,8, las muestras se deben de diluir, y las medidas resultantes se deben de multiplicar por un factor de dilución, de forma que el valor de OD no supere 0,8 unidades, y preferiblemente no supere 0,7 unidades. Sin embargo, tal dilución puede introducir errores en la determinación de la densidad celular, y hace imposible las mediciones en línea de la OD.

A título de explicación, la medición "en línea" de la densidad óptica de un cultivo implica el uso de una sonda in situ sumergida en un medio de cultivo, para monitorizar cambios en la densidad celular de un cultivo durante la fermentación. Sin embargo, tales métodos tienen la complicación añadida de que se deben de eliminar las burbujas de aire del medio de cultivo antes de la medición, a fin de producir una determinación exacta y fiable de la densidad óptica. De este modo, tales métodos requieren típicamente la adición de un dispositivo separado para desgasificar el medio, y consiguientemente no proporcionan un método para una medición continua de la densidad óptica del medio.

El uso de una sonda en línea para monitorizar cambios de concentración en un cultivo es conocido en la técnica.

Shiloach y Bahar (Sexto Congreso Europeo en Biotecnología, Florencia, Italia, 1993) describen el uso de un sensor en línea (Cerex Corporation), esterilizable, que es capaz de seguir cambios en la turbidez del cultivo. La sonda se basa en la emisión de luz de un cultivo, y proporciona una buena correlación con las medidas de la turbidez fuera de línea. La sonda se puede conectar por medio de una interfaz a un sistema de control y adquisición de datos, de forma que pueda proporcionar medidas directas durante el proceso de fermentación. Durante el funcionamiento de la sonda, un émbolo de teflón con un imán embebido se mueve ascendente y descendentemente como resultado de un campo magnético alterno. El movimiento del émbolo permite que el medio de cultivo fluya al interior de una cámara de toma de muestras dispuesta en la sonda, y facilita la eliminación de las burbujas de aire del medio de cultivo. Típicamente, el movimiento del émbolo es cíclico, de forma que está abierto durante un minuto y cerrado durante un minuto, proporcionando un nuevo valor de la densidad óptica cada dos minutos. De este modo, aunque el sensor en línea salva el requisito asociado con los sistemas fuera de línea en los que se retira una muestra de medio de cultivo del fermentador a fin de medir externamente la densidad óptica usando un espectofotómetro, la sonda descrita por Shiloach y Bahar no permite la medición continua de la densidad óptica.

Combs y Bishop (Encuentro Anual de la Sociedad para la Microbiología Industrial, Toronto, Canadá, 1993) describen el uso de una sonda en línea similar (Cerex Corporation) para medir la densidad óptica de un cultivo durante la fermentación. Durante el funcionamiento de la sonda, se abre un solenoide, el medio de cultivo entra en la cámara de toma de muestras, se cierra una válvula para eliminar las burbujas del cultivo a través de un puerto vertical, y se mide la densidad óptica de la muestra. De este modo, el funcionamiento de la sonda requiere la apertura y cierre de una válvula, de forma que la...

1. Un dispositivo exclusor de burbujas adaptado para uso con, y unido a, una sonda para la medición continua de la densidad celular de un cultivo en un medio líquido en un fermentador aireado, comprendiendo el dispositivo exclusor de burbujas una entrada y una salida para permitir el flujo de líquido a través del dispositivo, teniendo la entrada un conducto que, en uso, es sustancialmente vertical, comprendiendo el conducto un medio de exclusión de burbujas que crea una trayectoria de flujo en serpentín dentro del conducto, sirviendo el medio de exclusión de burbujas para reducir o evitar el ingreso de burbujas desde el medio líquido fuera del dispositivo.

2. Un dispositivo exclusor de burbujas según la reivindicación 1, en combinación con una sonda para la medición continua de la densidad celular de un cultivo, comprendiendo la sonda una abertura para toma de muestras expuesta al cultivo dentro del manguito del dispositivo exclusor de burbujas, para permitir que la sonda mida una característica del cultivo.

3. Una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según la reivindicación 2, en la que la sonda mide la densidad óptica de un medio de cultivo.

4. Una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según la reivindicación 2 ó 3, que comprende además un espectrofotómetro.

5. Una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según la reivindicación 4, en la que el espectro-fotómetro es un componente integrado de la sonda.

6. Una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según la reivindicación 4, en la que el espectro-fotómetro está enlazado ópticamente al resto de la sonda por medio de una o más fibras ópticas.

7. Un dispositivo exclusor de burbujas según la reivindicación 1, o una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que el medio de exclusión de burbujas comprende una pluralidad de deflectores, y/o una pluralidad de placas perforadas, y/o un canal con una sección transversal más pequeña que el diámetro de la mayoría de las burbujas presentes en el medio líquido.

8. Un dispositivo exclusor de burbujas según la reivindicación 1, o una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que el medio de exclusión de burbujas comprende deflectores dispuestos en ángulo con respecto al eje del conducto, de forma que están inclinados en una dirección ascendente.

9. Un dispositivo exclusor de burbujas o una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según la reivindicación 8, en el que al menos algunos de los deflectores están dispuestos para que solapen, para crear una trayectoria de flujo del fluido sinuosa o en serpentín entre los deflectores dentro del conducto.

10. Una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en la que al menos se proporciona un cierre estanco a los fluidos entre el dispositivo exclusor de burbujas y la superficie externa del cuerpo de una sonda.

11. Una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según la reivindicación 10, en la que se proporciona un cierre estanco a los fluidos a cada lado de la abertura para toma de muestras.

12. Un dispositivo exclusor de burbujas según la reivindicación 1, o una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en el que la salida está sustancialmente alineada de forma vertical con el conducto o la entrada.

13. Un fermentador que comprende un dispositivo exclusor de burbujas según la reivindicación 1 o una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12.

14. Un método para monitorizar la densidad celular de un cultivo durante la fermentación aerobia, comprendiendo el método el uso de una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 2-13.

15. Un método para excluir burbujas de una sonda en contacto de flujo fluido con un líquido que contiene burbujas, comprendiendo el método la etapa de unir un dispositivo exclusor de burbujas según la reivindicación 1 en relación operable con la sonda.