Anticuerpos que reconocen péptido beta amiloide.

Un anticuerpo que se une a Aβ, o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo,

en el que dichoanticuerpo o fragmento comprende:

a) una región variable de cadena ligera que comprende una primera, una segunda y una tercera regióndeterminante de complementariedad (CDR), en la que

la primera CDR comprende los aminoácidos 24-39 de SEC ID Nº: 2;

la segunda CDR comprende los aminoácidos 55-61 de SEC ID Nº: 2; y

la tercera CDR comprende los aminoácidos 94-101 de SEC ID Nº: 2; y

b) una región variable de cadena pesada que comprende una primera, una segunda y una tercera CDR, en laquela primera CDR comprende los aminoácidos 26-35 de SEC ID Nº: 4

la segunda CDR comprende los aminoácidos 50-66 de SEC ID Nº: 4 y

la tercera CDR comprende los aminoácidos 99-101 de SEC ID Nº: 4.

Anticuerpos que reconocen péptido beta amiloide Antecedentes de la invención La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad progresiva que da como resultado demencia senil. Véase en 5 general, Selkoe, TINS 16: 403 (1993) ; Hardy y col., documento WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol.

53:438 (1994) ; Duff y col., Nature 373: 476 (1995) ; Games y col., Nature 373: 523 (1995) . A grandes rasgos, la enfermedad se clasifica en dos categorías: aparición tardía, que se produce en edad avanzada (+65 años) y aparición temprana, que se desarrolla mucho antes del periodo senil, es decir, entre los 35 y los 60 años. En ambos tipos de enfermedad, la patología es la misma pero las anomalías tienden a ser más graves y generalizadas en 10 casos que comienzan a una edad más temprana. La enfermedad se caracteriza por al menos dos tipos de lesiones en el cerebro, ovillos neurofibrilares y placas seniles. Los ovillos neurofibrilares son depósitos intracelulares de proteína tau asociada a microtúbulos que consiste en dos filamentos enrollados entre sí en pares. Las placas seniles (es decir, placas amiloides) son áreas de neurópilos desorganizados de hasta 150 !m transversalmente con depósitos amiloides extracelulares en el centro que son visibles por análisis microscópico de secciones de tejido cerebral. La acumulación de placas amiloides dentro del cerebro también se asocia con el síndrome de Down y otros trastornos cognitivos.

El principal constituyente de las placas es un péptido denominado péptido A∀ o ∀-amiloide. El péptido A∀ es un fragmento interno de 4 kDa de 39-43 restos de aminoácidos de una glicoproteína transmembrana mayor denominada Proteína Precursora de Amiloide (APP) . Como resultado del procesamiento proteolítico de APP por 20 diferentes enzimas secretasa, A∀ se encuentra principalmente tanto en una forma corta, de 40 aminoácidos de longitud, como en una forma larga, que varía de 42-43 aminoácidos de longitud. Parte del dominio transmembrana hidrófobo de APP se encuentra en el extremo carboxilo de A∀, y puede explicar la capacidad de A∀ para agregarse en placas, particularmente en el caso de la forma larga. La acumulación de placas amiloides en el cerebro conduce con el tiempo a muerte de células neuronales. Los síntomas físicos asociados con este tipo de deterioro neural

caracterizan la enfermedad de Alzheimer.

Se han correlacionado varias mutaciones dentro de la proteína APP con la presencia de enfermedad de Alzheimer. Véase, por ejemplo, Goate y col., Nature 349: 704) (1991) (valina717 a isoleucina) ; Chartier Harlan y col. Nature 353: 844 (1991) ) (valina717 a glicina) ; Murrell y col., Science 254: 97 (1991) (valina717 a fenilalanina) ; Mullan y col., Nature Genet. 1: 345 (1992) (una doble mutación que cambia lisina595-metionina596 a asparagina595-leucina596) . Se cree que tales mutaciones provocan la enfermedad de Alzheimer por procesamiento aumentado o alterado de APP a A∀, particularmente procesamiento de APP a cantidades aumentadas de la forma larga de A∀ (es decir, A∀1-42 y A∀143) . Se cree que mutaciones en otros genes, tales como los genes de presenilina, PS1 y PS2, afectan indirectamente al procesamiento de APP para generar cantidades aumentadas de la forma larga A∀ (véase, Hardy, TINS 20: 154 (1997) ) .

Se han usado modelos de ratones de forma exitosa para determinar la importancia de las placas amiloides en la enfermedad de Alzheimer (Games y col., mencionado anteriormente, Johnson-Wood y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1550 (1997) ) . En particular, cuando se inyecta a ratones transgénicos PDAPP (que expresan un forma mutante de APP humana y desarrollan enfermedad de Alzheimer a una edad temprana) , la forma larga de A∀, estos presentan tanto una reducción de la progresión de Alzheimer como un aumento de los títulos de anticuerpos para el

péptido A∀ (Schenk y col., Nature 400, 173 (1999) ) . Las observaciones analizadas anteriormente indican que A∀, particularmente en su forma larga, es un elemento causante en enfermedad de Alzheimer.

El péptido A∀ puede existir en solución y puede detectarse en el SNC (por ejemplo, LCR) y plasma. En ciertas condiciones, A∀ soluble se transforma en formas de lámina-∀ fibrilares tóxicas halladas en placas neuríticas y vasos sanguíneos cerebrales de pacientes con AD. Se han investigado tratamientos que implican inmunización con 45 anticuerpos monoclonales contra A∀. Se ha ensayado inmunización tanto activa como pasiva en modelos de ratón de AD. La inmunización activa dio como resultado cierta reducción de la carga de placas en el cerebro, pero solamente cuando se administró por vía nasal. También se ha investigado la inmunización pasiva de ratones transgénicos PDAPP (Bard, y col. (2000) Nat. Med. 6: 916-19) . Se descubrió que los anticuerpos que reconocen los dominios amino-terminal y central de A∀ estimulan la fagocitosis de depósitos de A∀, mientras que los anticuerpos 50 contra dominios cerca del dominio carboxilo-terminal no.

El documento WO-A-03/016467 describe un procedimiento para tratar a un sujeto que tenga una afección o enfermedad relacionada con el péptido A∀ que comprende administrar al sujeto un anticuerpo que reconoce A∀, en el que el anticuerpo tiene una afinidad por A∀ soluble mayor de 10-9M. Más particularmente, el documento WO-A03/016467 describe un procedimiento para tratar los síntomas cognitivos de una afección o enfermedad asociada 55 con A∀ en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-A∀ que tenga mayor afinidad por A∀ soluble que la que tiene el anticuerpo 266.

Se está investigando de forma continuada el mecanismo de eliminación de A∀ después de inmunización pasiva o activa. Se han propuesto dos mecanismos para la eliminación eficaz, es decir, degradación central y degradación periférica. El mecanismo de degradación central se basa en anticuerpos que son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica, unirse a placas e inducir la eliminación de placas pre-existentes. Se ha mostrado que la eliminación se promueve a través de una fagocitosis mediada por receptor de Fc (Bard, y col. (2000) Nat. Med. 6: 916-19) . El mecanismo de degradación periférica de eliminación de A∀ se basa en una alteración del equilibrio dinámico de A∀ entre el cerebro, LCR y el plasma tras la administración de anticuerpo, que conduce al transporte de A∀ de un compartimento a otro. El A∀ derivado central se transporta al LCR y el plasma, en el que se degrada. Recientes estudios han sugerido que A∀ soluble y no unido están implicados en el deterioro de la memoria asociado con AD, incluso sin reducción de la deposición de amiloides en el cerebro. Se requieren estudios adicionales para determinar la acción y/o interacción de estas rutas para la eliminación de A∀ (Dodel, y col. (2003) The Lancet Vol. 2: 215) .

En consecuencia, existe la necesidad de nuevas terapias y reactivos para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer, en particular, terapias y reactivos capaces de efectuar un beneficio terapéutico a dosis fisiológicas (por ejemplo, no tóxicas) . Los enfoques exitosos para la prevención y/o tratamiento de AD incluyen intervenciones dirigidas a evitar la acumulación de A∀ y/o acelerar la eliminación de A∀, por ejemplo de placas de A∀.

Sumario de la invención La presente invención presenta nuevos reactivos inmunológicos, en particular, reactivos de anticuerpos terapéuticos para prevención y tratamiento de enfermedad amiloidogénica (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) así como déficits conductuales relevantes asociados con dicha enfermedad. La invención se basa en la identificación y caracterización de un anticuerpo monoclonal 15C11, que se une específicamente a A∀. Los anticuerpos que se unen a oligómeros de A∀ mejoran la cognición en mamíferos con trastornos amiloidogénicos. La invención concierne a anticuerpos que son capaces de mejorar rápidamente la cognición en un paciente como se demostró en modelos animales predictivos de eficacia en seres humanos.

El análisis estructural y funcional del anticuerpo 15C11 conduce al diseño de diversos anticuerpos humanizados para uso profiláctico y/o terapéutico. En particular, la invención presenta humanización de las regiones variables de este anticuerpo y, en consecuencia, proporciona cadenas de anticuerpos o inmunoglobulinas humanizadas, inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados intactos y fragmentos de anticuerpo o inmunoglobulinas funcionales, en particular, CDR o fragmentos... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo que se une a A∀, o un fragmento de unión a antígeno de dicho anticuerpo, en el que dicho anticuerpo o fragmento comprende:

a) una región variable de cadena ligera que comprende una primera, una segunda y una tercera región determinante de complementariedad (CDR) , en la que la primera CDR comprende los aminoácido.

2. 39 de SEC ID Nº: 2; la segunda CDR comprende los aminoácido.

5. 61 de SEC ID Nº: 2; y la tercera CDR comprende los aminoácido.

9. 101 de SEC ID Nº: 2; y b) una región variable de cadena pesada que comprende una primera, una segunda y una tercera CDR, en la que la primera CDR comprende los aminoácido.

2. 35 de SEC ID Nº: 4 la segunda CDR comprende los aminoácido.

5. 66 de SEC ID Nº: 4 y la tercera CDR comprende los aminoácido.

9. 101 de SEC ID Nº: 4.

2. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la región variable de cadena ligera comprende un polipéptido que tiene al menos 85% de identidad con los aminoácidos 1-111 de SEC ID Nº: 2; y la región variable de cadena pesada comprende un polipéptido que tiene al menos 85% de identidad con los aminoácidos 1-112 de SEC ID Nº: 4.

3. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 que es un anticuerpo monoclonal.

4. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que es un anticuerpo quimérico que comprende regiones constantes humanas.

5. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que es un anticuerpo humanizado.

6. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 5 que comprende

a) una región de cadena ligera humanizada que comprende las tres CDR de SEC ID Nº: 2 como se define en la reivindicación 1 (a) , y un marco de región variable de una secuencia marco de región variable de cadena ligera humana que tiene opcionalmente al menos un resto marco seleccionado del grupo que consiste en un resto canónico, un resto de vernier, un resto de empaquetamiento y un resto poco habitual, ocupado por el mismo resto de aminoácido presente en la posición equivalente del marco de región variable de cadena ligera de SEC ID Nº: 2; y b) una cadena pesada humanizada que comprende las tres CDR de SEC ID Nº: 4 como se define en la reivindicación 1 (b) , y un marco de región variable de una secuencia marco de región variable de cadena pesada humana que tiene opcionalmente al menos un resto marco seleccionado del grupo que consiste en un resto canónico, un resto de vernier, un resto de empaquetamiento y un resto poco habitual, ocupado por el mismo resto de aminoácido presente en la posición equivalente del marco de la región variable de cadena pesada de SEC ID Nº: 4.

7. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 6 en el que el marco de región variable de cadena ligera humana es de una región variable de cadena ligera kappa.

8. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 6 o la reivindicación 7 en el que el marco de región variable de cadena pesada humana es de una región variable de cadena pesada de IgG1 o IgG4.

9. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8 en el que:

a) el marco de región variable de cadena ligera es de una cadena ligera humana que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEC ID Nº: 2; y/o b) el marco de región variable de cadena pesada es de una cadena pesada humana que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con SEC ID Nº: 4.

10. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que se une específicamente a A∀ con una afinidad de unión de al menos 10-7 M como se midió por diálisis en equilibrio o el procedimiento BIACORE cinético.

11. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que se une a péptido beta amiloide (A∀) soluble.

12. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que se une a péptido beta amiloide (A∀) oligomérico.

13. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que captura

péptido beta amiloide (A∀) .

14. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que cruza la barrera hematoencefálica en un paciente.

15. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que reduce la carga de placas de péptido amiloide en un paciente.

16. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente para uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad amiloidogénica en un paciente.

17. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso de acuerdo con la reivindicación 16 en el que la enfermedad amiloidogénica es enfermedad de Alzheimer.

18. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso de acuerdo con la reivindicación 16 o la reivindicación 17 en el que el anticuerpo se administra a 1 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg.

19. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquier reivindicación precedente para uso como un medicamento.

20. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 19 para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno amiloidogénico o relacionado con A∀.

21. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 20 para uso en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer

22. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso de acuerdo con las reivindicaciones 19-21, en el que el paciente es humano.

23. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso de acuerdo con las reivindicaciones 19-22, en el que el anticuerpo se administra a una dosis de 100 !g/kg a 100 mg/kg de peso corporal del paciente.

24. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso de acuerdo con las reivindicaciones 19-23 en el que se consigue mejora rápida de la cognición en un período de 48 horas desde la administración del anticuerpo.

25. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-15 y un vehículo farmacéutico.

26. Una molécula de ácido nucleico aislada o moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

27. Una molécula o moléculas de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la reivindicación 26 que comprenden las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 3.

28. Un vector que comprende la molécula o moléculas de ácido nucleico de la reivindicación 26 o la reivindicación

27.

29. Una célula huésped no humana o una célula huésped humana no embrionaria aislada, que comprende la molécula o moléculas de ácido nucleico de la reivindicación 26 o la reivindicación 27.

30. Un animal transgénico no humano que expresa un polipéptido codificado por la molécula o las moléculas de ácido nucleico de la reivindicación 26 o la reivindicación 27.

31. Un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1-15 que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 29 en condiciones tales que se produzca el anticuerpo o fragmento y aislar dicho anticuerpo o fragmento del cultivo de células huésped.

Figura 1

Efecto de mAb de A CENTRALES 2B1, 1C2 y 15C11 en la memoria contextual en ratones Tg2576

Figura 2

Efecto de 15C11 de dosis baja en la memoria contextual en ratón Tg2576

Figura 3

Figura 4

Figura 5

FIGURA 6