Anticuerpos monoclonales de conejo a antígenos de superficie de hepatitis B y métodos de utilización de los mismos.

Anticuerpo monoclonal de conejo contra el virus de la hepatitis B (VHB),

o un fragmento inmunorreactivo del mismo, que reconoce los mutantes de antígenos de superficie de la hepatitis B de (HBsAg) F134A, F134S, G145R, S143L, P142S y Q129R/M133T.

Anticuerpos monoclonales de conejo a antígenos de superficie de hepatitis B y métodos de utilización de los mismos SECTOR TÉCNICO

La presente invención se refiere en general al virus de la hepatitis B (VHB) . En particular, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales de conejo dirigidos contra antígenos de superficie de VHB y métodos de utilización de los mismos para el diagnóstico de infección de VHB.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

El virus de la hepatitis B (VHB) es un miembro de un grupo de virus pequeños que contienen ADN que provocan infecciones no citopáticas persistentes del hígado. La infección por VHB en humanos puede provocar ictericia severa, degeneración hepática y muerte. El VHB entra predominantemente por la ruta parenteral, tiene un periodo característico de incubación de 60 a 160 días, puede persistir en la sangre durante años en portadores crónicos. El VHB es de gran importancia médica debido a que es una de las causas más comunes de enfermedad hepática crónica, tal como carcinoma hepatocelular, en humanos. Los hepatocitos infectados secretan de forma continua partículas virales que se acumulan en altos niveles en la sangre. Además, se estima que aproximadamente del 6 al 7% de la población humana está infectada, con el nivel de infección siendo tan alto como del 20% de la población en ciertas regiones del sudeste asiático y Ã?frica subsahariana.

Se han empleado varias pruebas para detectar la presencia de los constituyentes de VHB en suero y otros fluidos corporales. Estas pruebas son predominantemente de principio inmunológico y dependen de la presencia de anticuerpos producidos en humanos o animales para detectar proteínas virales específicas, tales como el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) , antígeno de núcleo (nucleocápside) de la hepatitis B (HBcAg) o antígeno "E" de la hepatitis B (HBeAg) . Sin embargo, hay una preocupación creciente acerca de la contribución de las variantes con relación a la producción de negativos falsos de HBsAg en ensayos de diagnosis serológica de HBsAg o de cribaje de sangre.

En particular, el VHB, debido a su modo de replicación por trascripción inversa de su ARN pre-genómico, tiene una alta tasa de mutación respecto a otros virus de ADN. Se han descrito sustituciones de aminoácidos en todas las proteínas virales codificadas por ADN del VHB tales como la polimerasa, HBcAg y HBsAg. La región determinante "a" específica de grupo del VHB (aminoácidos 127-147, numerada con respecto a la porción S de HBsAg) ha atraído la mayor atención, debido a que se han encontrado mutaciones en esta región en el 10-20% de las evasiones de la vacuna y han resultado en el diagnóstico erróneo de las variantes de VHB, aun utilizando los ensayos serológicos más actuales en el mercado. De esta manera, existe la necesidad del desarrollo de pruebas fiables de diagnóstico para detectar el VHB en muestras víricas, con el fin de prevenir la transmisión del virus a través de derivados de sangre y plasma o por contacto personal cercano.

Se han utilizado hibridomas de conejo-conejo y conejo-ratón en un intento de generar anticuerpos monoclonales con inmunorreactividad incrementada. Véase, por ejemplo, las patentes en Estados Unidos números 4.977.081; 4.859.595; 5.472.868; 5.675.063; Spieker-Polet y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1995) 92:9348-9352. Son deseables anticuerpos monoclonales de conejo por varias razones. Primero, los conejos pueden reconocer antígenos y epítopos que no son inmunogénicos en ratones o ratas, las dos especies a partir de las cuales normalmente se generan los anticuerpos monoclonales. Adicionalmente, los anticuerpos de conejo en general son de alta afinidad. La patente en Estados Unidos número 4.859.595 describe la producción de anticuerpos monoclonales de conejo contra HBsAg utilizando fusiones de conejo-conejo.

Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de inmunoensayos mejorados que utilicen anticuerpos monoclonales con inmunorreactividad más amplia contra los varios mutantes de HBsAg. Sería altamente deseable la disponibilidad generalizada de reactivos para utilización en un ensayo preciso y eficiente para la infección por VHB.

CARACTERÃ?STICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales altamente inmunorreactivos para el diagnóstico simple, exacto y eficiente de la infección por VHB. Los anticuerpos se producen a partir de hibridomas de conejo y son inmunorreactivos contra varias cepas mutantes de VHB. Por tanto, los métodos de ensayo que utilizan los anticuerpos monoclonales de conejo son más exactos y se reduce el número de falsos negativos vistos con otras pruebas serológicas. Los ensayos que utilizan los anticuerpos permiten por lo tanto la detección de la infección por VHB provocada por una variedad de mutantes del VHB y, si se detecta infección, al individuo se le puede dar el tratamiento apropiado en tiempo adecuado para ayudar a prevenir el daño hepático y la muerte.

Por consiguiente, en una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal de conejo

anti-VHB que reconoce los mutantes de HBsAg F134A, F134S, G145R, S143L, P142S o Q12 9R/M133T, o un fragmento inmunorreactivo del mismo, tal como un fragmento Fab, F (ab') 2, Fv o un sFv. En realizaciones adicionales, el anticuerpo también reconoce un HBsAg tipo salvaje. Cualquiera de los anticuerpos anteriores se puede producir utilizando un hibridoma de conejo-conejo o un hibridoma de conejo-ratón.

En realizaciones adicionales, la invención se refiere a los hibridomas 99S6 (número de acceso ATCC PTA-6015) y 99S9 (número de acceso ATCC PTA-6014) y anticuerpos producidos por estos hibridomas. En realizaciones adicionales, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal de conejo que reconoce el mismo epítopo que un anticuerpo producido por el hibridoma 99S6 y/o 99S9.

En realizaciones adicionales, la invención se refiere a un método para detectar antígenos de superficie del VHB en una muestra biológica. El método comprende:

poner en contacto la muestra biológica, como mínimo, con un anticuerpo monoclonal de conejo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, bajo condiciones que permiten que los antígenos del VHB, cuando están presentes en la muestra biológica, se unan al anticuerpo para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y

detectar la presencia o ausencia del complejo de anticuerpo/antígeno, detectando de este modo la presencia o ausencia de los antígenos de superficie del VHB en la muestra.

En realizaciones preferentes del método anterior, el, como mínimo, un anticuerpo monoclonal de conejo es el anticuerpo producido por el hibridoma 99S6 o el hibridoma 99S9. En ciertas realizaciones, el, como mínimo, un anticuerpo monoclonal de conejo se marca de forma detectable. En ciertas realizaciones, el método además comprende hacer reaccionar la muestra biológica con uno o más anticuerpos adicionales dirigidos contra un HBsAg tipo salvaje o un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a". Los uno o más anticuerpos adicionales pueden comprender un anticuerpo monoclonal adicional, tal como un anticuerpo monoclonal de ratón.

En realizaciones adicionales, la invención se refiere a un kit de ensayo inmunodiagnóstico para detectar infección por VHB. El kit de ensayo comprende:

al menos un anticuerpo monoclonal de conejo, o un fragmento inmunorreactivo del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores; o un soporte sólido que comprende, como mínimo, un anticuerpo monoclonal de conejo o un fragmento inmunorreactivo del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores.

En realizaciones preferentes del método anterior, el, como mínimo, un anticuerpo monoclonal de conejo es el anticuerpo producido por el hibridoma 99S6 o el hibridoma 99S9. En ciertas realizaciones, el kit de ensayo además comprende uno o más anticuerpos adicionales dirigidos contra un HBsAg tipo salvaje o un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a". Los uno o más anticuerpos adicionales pueden comprender un anticuerpo monoclonal adicional, tal como un anticuerpo monoclonal de conejo.

En realizaciones adicionales, la invención se refiere a realizaciones preferentes del soporte sólido, el como mínimo, un anticuerpo monoclonal de conejo es el anticuerpo producido por el hibridoma 99S6 o el hibridoma 99S9. En ciertas realizaciones, el soporte además comprende uno o más anticuerpos adicionales dirigidos contra un HBsAg tipo salvaje o un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a". Los uno o más anticuerpos adicionales pueden comprender un anticuerpo monoclonal adicional,... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal de conejo contra el virus de la hepatitis B (VHB) , o un fragmento inmunorreactivo del

mismo, que reconoce los mutantes de antígenos de superficie de la hepatitis B de (HBsAg) F134A, F134S, 5 G145R, S143L, P142S y Q129R/M133T.

2. Anticuerpo monoclonal de conejo, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo también reconoce un HBsAg de tipo salvaje.

3. Anticuerpo monoclonal de conejo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo se produce utilizando:

a. un hibridoma de conejo-conejo, o

b. un hibridoma de conejo-ratón.

4. Anticuerpo, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo:

a. es producido por el hibridoma 99S6, número de acceso ATCC PTA-6015.

b. es producido por el hibridoma 99S9, número de acceso ATCC PTA-6014, o

c. reconoce el mismo epitopo que un anticuerpo producido por el hibridoma 99S6, número de acceso ATCC

PTA-6015 o 99S6 número de acceso ATCC PTA-6014. 20

5. Fragmento, según la reivindicación 1, en el que el fragmento es un fragmento Fab, F (ab’) 2, Fv o sFv.

6. Hibridoma que produce el anticuerpo, según la reivindicación 1, en el que el hibridoma es:

a. hibridoma 99S6, número de acceso ATCC PTA-6015, o 25 b. hibridoma, 99S9, número de acceso ATCC PTA-6014.

7. Método para detectar antígenos de superficie del VHB en una muestra biológica, que comprende:

(a) poner en contacto dicha muestra biológica con, como mínimo, un anticuerpo monoclonal de conejo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, bajo condiciones que permitan a los antígenos del VHB, cuando están 30 presentes en la muestra biológica, unirse al anticuerpo para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y

(b) detectar la presencia o ausencia de dicho complejo de anticuerpo/antígeno, detectando de esta manera la presencia o ausencia de antígenos de superficie del VHB en dicha muestra.

8. Método, según la reivindicación 7, en el que dicho, como mínimo, un anticuerpo monoclonal de conejo se 35 marca de forma detectable.

9. Método, según la reivindicación 7, en el que el método comprende además hacer reaccionar dicha muestra biológica con uno o más anticuerpos adicionales dirigidos contra un HBsAg tipo salvaje o un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a".

10. Kit de prueba inmunodiagnóstico, para detectar infección por VHB, dicho kit de prueba que comprende:

a. como mínimo, un anticuerpo monoclonal de conejo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o

b. un soporte sólido que comprende, como mínimo, un anticuerpo monoclonal de conejo o un fragmento

inmunorreactivo del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5. 45

11. Soporte sólido que comprende, como mínimo, un anticuerpo monoclonal de conejo o un fragmento inmunorreactivo del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

12. Kit de prueba inmunodiagnóstico, según la reivindicación 10, o soporte sólido, según la reivindicación 11, en

el que el kit de prueba o el soporte comprenden además uno o más anticuerpos adicionales dirigidos contra un HBsAg tipo salvaje o un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante “a”.

13. Método, según la reivindicación 9, kit de prueba inmunodiagnóstico, según la reivindicación 12, o soporte sólido, según la reivindicación 12, en el que los uno o más anticuerpos adicionales comprenden un anticuerpo 55 monoclonal adicional.

14. Método, kit de prueba inmunodiagnóstico o soporte sólido, según la reivindicación 13, caracterizados porque los uno o más anticuerpos adicionales comprenden un anticuerpo monoclonal de ratón.

15. Soporte sólido, según la reivindicación 11, que comprende además, como mínimo, dos controles internos, caracterizados porque uno de los controles define el límite inferior de detección para un resultado positivo en un inmunoensayo que utiliza el soporte sólido y el otro control define un resultado altamente positivo en un inmunoensayo que utiliza el soporte sólido.

16. Soporte sólido, según la reivindicación 11, en el que el soporte sólido es una tira de nitrocelulosa.

17. Método para detectar la presencia de antígenos de superficie del VHB en una muestra biológica, dicho método que comprende: (a) proporcionar una muestra biológica; (b) proporcionar un soporte sólido, según cualquiera de las reivindicaciones 11-16; (c) poner en contacto dicha muestra biológica con dicho soporte sólido, bajo condiciones que permitan que los antígenos de superficie del VHB, si están presentes en la muestra biológica, se unan con, como mínimo, uno de los anticuerpos monoclonales de conejo, según las reivindicaciones 1-5, para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y (d) detectar la presencia del complejo de anticuerpo/antígeno, detectando de esta manera la presencia de antígenos de superficie del VHB en la muestra biológica.

18. Método, según la reivindicación 17, que además comprende: (e) eliminar los antígenos de VHB no unidos; (f) proporcionar uno o más restos capaces de asociarse con dicho complejo de anticuerpo/antígeno; y (g) detectar la presencia de dichos uno o más restos, detectando de esta manera la presencia de antígenos de superficie del VHB en la muestra biológica.

19. Método, según la reivindicación 18, en el que dicho uno o más restos comprende un anticuerpo contra el VHB marcado de forma detectable.

20. Método, según la reivindicación 19, en el que el anticuerpo contra el VHB marcado de forma detectable es un anticuerpo monoclonal de conejo que reconoce un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a", o un fragmento inmunorreactivo del mismo.

21. Método, según la reivindicación 8 ó 19, en el que la marca detectable es una enzima.

22. Método, según la reivindicación 7, en el que la muestra biológica es de una muestra sanguínea humana.

23. Método para detectar la presencia de anticuerpos anti-HBsAg en una muestra biológica, dicho método que comprende: (a) proporcionar un soporte sólido, según cualquiera de las reivindicaciones 11-16; (b) poner en contacto dicho soporte sólido con uno o más HBsAgs, bajo condiciones que permitan que los uno o más HBsAgs se unan con, como mínimo, uno de los anticuerpos monoclonales de conejo, según las reivindicaciones 1-5, para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; (d) poner en contacto dicho soporte sólido que tiene el complejo de anticuerpo/antígeno con una muestra biológica, bajo condiciones que permitan que los anticuerpos de anti-HBsAg, si están presentes en la muestra biológica, se unan al complejo de anticuerpo/antígeno para formar un complejo de anticuerpo/antígeno/anticuerpo; y (e) detectar la presencia del complejo de anticuerpo/antígeno/anticuerpo, detectando de esta manera la presencia de anticuerpos anti-HBsAg en la muestra biológica.

24. Método, según la reivindicación 23, que además comprende: (f) eliminar los anticuerpos no unidos; (g) proporcionar uno o más restos capaces de asociarse con dicho complejo de anticuerpo/antígeno/anticuerpo; y (h) detectar la presencia de dicho uno o más restos, detectando de esta manera la presencia de anticuerpos anti-HBsAg de la muestra biológica.

25. Método, según la reivindicación 24, en el que dicho uno o más restos comprende una molécula de inmunoglobulina marcada de forma detectable.

26. Método para preparar un suministro sanguíneo que comprende sangre entera, plaquetas, plasma o suero, sustancialmente libre de VHB, que comprende: (a) cribar alícuotas de sangre entera, plaquetas, plasma o suero de las muestras sanguíneas recolectadas, según el método de la reivindicación 22 o la reivindicación 23; (b) eliminar cualquier muestra en la que se detecte un antígeno de VHB; (c) combinar las muestras en las que no se detecte antígeno del VHB para proporcionar un suministro sanguíneo sustancialmente libre de VHB.

27. Método para cribar un tejido u órgano donado antes del transplante para proporcionar un tejido u órgano sustancialmente libre de VHB, que comprende: (a) cribar una muestra de dicho tejido u órgano por el método según la reivindicación 7 o la reivindicación 23; (b) eliminar un tejido u órgano en el que se detecte un antígeno del VHB para proporcionar un tejido u órgano sustancialmente libre de VHB.

28. Método para preparar un anticuerpo monoclonal de conejo anti-VHB, dicho método que comprende: (a) inmunizar un conejo con un mutante de HBsAg con una mutación en la región determinante "a", en el que el mutante de HBsAg comprende la secuencia de la región determinante “a” de F134A, F134S, G145R, S143L, P142S o Q129R/M133T; (b) fusionar células que producen anticuerpos contra el mutante de HBsAg de dicho conejo con una célula de una línea celular inmortalizada para producir un hibridoma; (c) seleccionar dicho hibridoma; (d) cultivar dicho hibridoma seleccionado; y (e) recolectar el anticuerpo secretado por dicho hibridoma cultivado.

29. Método, según la reivindicación 28, en el que el paso de inmunización comprende inmunizar un conejo con más de un mutante de HBsAg.

30. Método, según la reivindicación 28, en el que dichas células productoras de anticuerpo son esplenocitos de conejo.

31. Método, según la reivindicación 30, en el que dichos esplenocitos se fusionan con una célula de una línea 5 celular inmortalizada de conejo para producir un hibridoma de conejo-conejo.

32. Método, según la reivindicación 31, en el que la línea celular inmortalizada de conejo es un plasmacitoma de conejo.

33. Método, según la reivindicación 31, en el que dichos esplenocitos se fusionan con una célula de una línea celular inmortalizada de ratón para producir un hibridoma de conejo-ratón.

34. Método, según la reivindicación 26, en el que el conejo se inmuniza con, como mínimo, dos mutantes de HBsAg seleccionados del grupo que comprende F134A, F134S, G145R, S143L, P142S o Q129R/M133T. 15

35. Método, según la reivindicación 26, en el que el conejo se inmuniza con los mutantes de HBsAg F134A, F134S, G145R, S143L, P142S y Q129R/M133T.

36. Método, según la reivindicación 26, en el que el conejo se inmuniza adicionalmente con un HBsAg tipo 20 salvaje.

37. Método para preparar un hibridoma de conejo-conejo, según la reivindicación 6, que comprende: (a) inmunizar un conejo con un mutante de HBsAg con una mutación de la región determinante "a", en el que el mutante de HBsAg comprende la secuencia de la región determinante “a” de F134A, F134S, G145R, S143L y

Q129R/M133T; (b) fusionar esplenocitos que producen anticuerpos contra el mutante de HBsAg del conejo con células de un plasmacitoma de conejo; (c) seleccionar células que secreten dichos anticuerpos.

38. Polinucleótido, que codifica para un anticuerpo monoclonal de conejo o un fragmento inmunorreactivo del

mismo, según la reivindicación 1. 30

39. Polinucleótido, según la reivindicación 38, en el que el fragmento inmunorreactivo codificado por el polinucleótido es un fragmento Fab, F (ab') 2, Fv o un sFv.

40. Utilización de un anticuerpo monoclonal de conejo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en un 35 método para detectar antígenos de superficie del VHB en una muestra biológica.

41. Utilización de un soporte sólido, según cualquiera de las reivindicaciones 11-16, en un método para detectar la presencia de antígenos de superficie del VHB y/o anticuerpos contra HBsAg en una muestra biológica.

42. Utilización de un anticuerpo monoclonal de conejo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en un método para preparar un suministro sanguíneo que comprende sangre entera, plaquetas, plasma o suero, sustancialmente libre de VHB.

43. Utilización de un anticuerpo monoclonal de conejo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en un 45 método para cribar un tejido u órgano donado antes del transplante para proporcionar un tejido u órgano sustancialmente libre de VHB.