Anticuerpos humanizados que reconocen el péptido beta-amiloide.

Un anticuerpo humanizado ß-amiloide (Aß) o un fragmento de unión a antígeno del mismo,

que comprendeuna región variable de cadena ligera humanizada que tiene la secuencia de SEC ID N.º 7, en la queXaa en posición 1 es Asp o Tyr;

Xaa en posición 7 es Ser o Thr;

Xaa en posición 10 es Ser o Thr;

Xaa en posición 15 es Leu, Ile, o Val;

Xaa en posición 50 es Arg o Lys;

Xaa en posición 88 es Val o Leu; y

Xaa en posición 109 es Val o Leu;

y una región variable pesada humanizada que tiene la secuencia de SEC ID N.º: 8, en la queXaa en posición 3 es Gln, Lys, o Arg;

Xaa en posición 78 es Ser o Thr;

Xaa en posición 87 es Arg o Lys;

Xaa en posición 88 es Ala, Ser, o Thr; y

Xaa en posición 114 es Leu, Thr, Ile, o Val en el que el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígenodel mismo incrementa los niveles de Aß plasmáticos.

Anticuerpos humanizados que reconocen el péptido beta–amiloide La presente solicitud reivindica la prioridad del documento US 60/287.539 presentado el 30 de abril de 2001.

La invención se refiere a anticuerpos humanizados útiles para tratar y prevenir enfermedades humanas asociadas con el β–amiloide (Aβ) , tales como la enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down y la angiopatía amiloide cerebral. El anticuerpo monoclonal de ratón 3D6 ha sido ampliamente usado en procedimientos analíticos. Tras administrar el 3D6 a un grupo de ratones PDAPP transgénicos heterocigóticos de 11, 5–12 meses de edad (APPV717F) a una dosis intraperitoneal semanal de aproximadamente 10 mg/kg durante seis meses, se publicó que los ratones habían reducido significativamente la carga de la placa, aunque no se reveló la ubicación específica de la reducción. [Bard, F. y cols., Nature Med. 6: 916–919 (2000) ; documentos WO 00/72876 y WO 00/72880, 7 de diciembre de 2000]. Se afirmó que el anticuerpo accedió al sistema nervioso central en suficientes cantidades como para “empapelar” las placas de β–amiloide. Finalmente, se afirmó que el 3D6 de ratón induce a la fagocitosis de la placa de amiloide en estudios in vitro.

En la publicación PCT W099/27944, publicada el 10 de junio de 1999, se describen procedimientos para administrar agregado de Aβ1–42 para provocar una respuesta inmunológica y reducir los depósitos de amiloide. La descripción postula que el péptido Aβ agregado de longitud completa sería un inmunógeno útil. La solicitud también indica que se podrían usar los anticuerpos que se unen al péptido Aβ como agentes terapéuticos alternativos. Sin embargo, esto parece ser una especulación, pues los datos que lo respaldan reflejan protocolos que implican inmunización activa usando, por ejemplo, Aβ1–42.

El documento WO 99/60024, publicado el 25 de noviembre de 1999, se refiere a procedimientos para la eliminación de amiloides mediante el uso de anticuerpos anti–amiloides. Sin embargo, se establece que el mecanismo utiliza la capacidad de los anticuerpos anti–Aβ para unirse a depósitos de amiloide pre–formados (es decir, placas) y da como resultado el posterior aclaramiento microglial de las placas localizadas. Este mecanismo no se probó in vivo. Esta publicación establece además que para que sean eficaces frente a las placas de Aβ, los anticuerpos anti–Aβ deben administrarse directamente en el cerebro, porque los anticuerpos no pueden atravesar la barrera hematoencefálica.

Queen y cols. describen procedimientos para humanizar anticuerpos [p. ej., las patentes estadounidenses N.ºs 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 6.180.370].

Las formas humanizadas de 3D6 son necesarias para su uso en seres humanos que padecen el síndrome de Down o la enfermedad de Alzheimer pre–clínica o clínica, o la angiopatía amiloide cerebral (AAC) . Sin embargo, no se sabe si es posible humanizar los 3D6, tal que el anticuerpo humanizado conserve las propiedades de unión del anticuerpo de ratón.

Sumario de la invención La presente invención proporciona formas humanizadas de 3D6. Estos anticuerpos humanizados tienen propiedades de unión (afinidad y localización de epítopos) que son aproximadamente las mismas que las del anticuerpo 3D6 de ratón. La invención incluye anticuerpos, anticuerpos monocatenarios y fragmentos de los mismos. La invención incluye anticuerpos en los que las CDR son las del anticuerpo monoclonal de ratón 3D6 (secuencias de SEC ID N.º 1 a SEC ID N.º 6) y en los que los anticuerpos conservan aproximadamente las propiedades de unión del anticuerpo de ratón y tienen propiedades in vitro e in vivo funcionalmente equivalentes a las del anticuerpo de ratón. En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos, en los que las regiones variables tienen secuencias que comprenden la CDR del anticuerpo de ratón 3D6 y secuencias marco humanas específicas (secuencias de SEC IDN.º 7–SEC ID N.º 10) , en los que los anticuerpos conservan aproximadamente las propiedades de unión del anticuerpo de ratón y tienen propiedades in vitro e in vivo funcionalmente equivalentes a las del anticuerpo de ratón 3D6. En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos, en los que la cadena ligera es la SEC ID N.º 11 y la cadena pesada es la SEC ID N.º 12.

También forman parte de la invención las secuencias de polinucleótidos que codifican los anticuerpos humanizados o los fragmentos de los mismos revelados anteriormente, vectores que comprenden las secuencias de polinucleótidos codificantes de los anticuerpos humanizados o los fragmentos de los mismos, células huésped transformadas con los vectores o que incorporan los polinucleótidos que expresan los anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos, formulaciones farmacéuticas de los anticuerpos humanizados y de los fragmentos de los mismos revelados en la presente memoria y procedimientos para elaborar y usar las mismas.

Tales anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos son útiles para, entre otras cosas, tratar y evitar enfermedades y afecciones caracterizadas por las placas de Aβ o la toxicidad del Aβ en el cerebro, tales como la enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down y la angiopatía amiloide cerebral en seres humanos.

La invención también incluye el uso de un anticuerpo humanizado de la presente invención para la fabricación de un medicamento, incluyendo la expresión prolongada de las secuencias recombinantes del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo en tejidos humanos, para tratar, evitar o invertir la enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down o la angiopatía amiloide cerebral, o para inhibir la formación de placas de amiloide o los efectos de las especies de Aβ solubles tóxicas en seres humanos.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención se proporciona un anticuerpo humanizado β–amiloide 5 (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprendiendo una región variable de cadena ligera humanizada que tiene la secuencia de SEC ID N.º 7, en la que Xaa en posición 1 es Asp o Tyr; Xaa en posición 7 es Ser o Thr; Xaa en posición 10 es Ser o Thr; 10 Xaa en posición 15 es Leu, Ile, o Val; Xaa en posición 50 es Arg o Lys; Xaa en posición 88 es Val o Leu; y Xaa en posición 109 es Val o Leu; y una región variable pesada humanizada que tiene la secuencia de SEC ID N.º: 8, en la que 15 Xaa en posición 3 es Gln, Lys, o Arg; Xaa en posición 78 es Ser o Thr; Xaa en posición 87 es Arg o Lys; Xaa en posición 88 es Ala, Ser, o Thr; y Xaa en posición 114 es Leu, Thr, Ile, o Val en el que el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo incrementa los niveles de Aβ plasmáticos. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un fragmento de unión a antígeno obtenible por escisión enzimática del anticuerpo humanizado en la presente invención.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un fragmento Fab o F (ab’) 2 del anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2. 25 Preferentemente, el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo monocatenario. Preferentemente, el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la presente invención es un isotipo de inmunoglobulina IgG1.

Más preferentemente, el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la presente 30 invención se producir en una células huésped seleccionada de una célula de mieloma, una célula ovárica de hámster chino, una célula ovárica de hámster sirio y una célula de riñón embrionaria humana. De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un compuesto polinucleotídico, que comprende una secuencia codificante para la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un compuesto polinucleotídico, que cuando se expresa en una célula huésped adecuada, proporciona un anticuerpo de la presente invención. Preferentemente, el polinucleótido está seleccionado de SEC ID N.º 15, SEC ID N.º 17 y es un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para la región variable de la cadena ligera dada por SEC ID N.º 7, SEC ID N.º 9, o SEC ID N.º 11.

Preferentemente, el polinucleótido está... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humanizado β–amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera humanizada que tiene la secuencia de SEC ID N.º 7, en la que Xaa en posición 1 es Asp o Tyr; 5 Xaa en posición 7 es Ser o Thr; Xaa en posición 10 es Ser o Thr; Xaa en posición 15 es Leu, Ile, o Val; Xaa en posición 50 es Arg o Lys; Xaa en posición 88 es Val o Leu; y 10 Xaa en posición 109 es Val o Leu; y una región variable pesada humanizada que tiene la secuencia de SEC ID N.º: 8, en la que Xaa en posición 3 es Gln, Lys, o Arg; Xaa en posición 78 es Ser o Thr; Xaa en posición 87 es Arg o Lys;

Xaa en posición 88 es Ala, Ser, o Thr; y Xaa en posición 114 es Leu, Thr, Ile, o Val en el que el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo incrementa los niveles de Aβ plasmáticos.

2. Un fragmento de unión a antígeno obtenible por escisión enzimática del anticuerpo humanizado de la reivindicación 1.

3. Un fragmento de Fab o F (ab’) 2 del anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Un fragmento de F (ab’) 2 de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Un fragmento de Fab de acuerdo con la reivindicación 3.

6. Un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de 25 las reivindicaciones 1 a 5 que es un anticuerpo de cadena simple.

7. Un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que es un isotipo de inmunoglobulina IgG1.

8. Un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a anticuerpo del mismo se produce en una

célula huésped a partir de una célula de mieloma, una célula de ovario de hámster chino, una célula de ovario de hámster sirio y una célula renal embrionaria humana.

9. Un compuesto polinucleotídico, que comprende una secuencia que codifica para la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo humanizado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

10. Una secuencia polinucleotídica, que cuando se expresa en una célula huésped adecuada, proporciona un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 seleccionado de SEC ID N.º 15, SEC ID N.º 17 y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para la región variable de cadena ligera dado por SEC ID N.º 7, SEC ID N.º 9, o SEC ID N.º 11.

12. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 seleccionado de SEC ID N.º 16, SEC ID N.º 18 y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para la región variable de cadena pesada dado por SEC ID N.º 8, SEC ID N.º 10, o SEC ID N.º 12.

13. Un vector de expresión para expresar el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende la secuencia de polinucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.

14. Una célula transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 13.

15. Una célula transfectada con dos vectores de expresión de la reivindicación 13, en la que un primer vector comprende la secuencia polinucleotídica que codifica para la cadena ligera y un segundo vector comprende la secuencia que codifica para la cadena pesada.

16. Una célula que es capaz de expresar el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

17. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en la que la célula se selecciona de una célula de mieloma, una célula de ovario de hámster chino, una célula de ovario de hámster sirio y una célula renal embrionaria humana.

18. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

19. Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en terapia.

20. Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento de síndrome de Down, enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, o angiopatía amiloide cerebral clínica o preclínica en un sujeto humano.

21. Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en la inhibición de la formación de placa de Aβ en el cerebro de un sujeto humano.

22. Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en la reducción de la placa de Aβ en el cerebro de un sujeto humano.

23. Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) para su uso de acuerdo con la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en el que el sujeto está diagnosticado con enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, síndrome de Down, o angiopatía amiloide cerebral clínica o preclínica.

24. Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) para su uso de acuerdo con la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en el que el sujeto no está diagnosticado con enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, síndrome de Down, o angiopatía amiloide cerebral clínica o preclínica.

25. Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, síndrome de Down, o angiopatía amiloide cerebral clínica o preclínica.

26. Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer.

27. Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de una enfermedad humana asociada con amiloide β, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo incrementa Aβ soluble en el plasma.

28. Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 27, en el que la enfermedad humana es Alzheimer preclínico, síndrome de Down, o angiopatía amiloide cerebral preclínica.