Anticuerpos diseñados racionalmente.

Anticuerpo o fragmento del mismo, en el que dicho fragmento comprende un Fab,

un F (ab') 2, un scFv, un Fv, una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera de dicho anticuerpo, que comprende una región

i) en la que los residuos aminoácidos que corresponden a por lo menos una parte de un región determinante de complementariedad (CDR) se sustituyen por un péptido biológicamente activo, o

ii) en la que un péptido biológicamente activo es insertado en una CDR, en el que el péptido biológicamente activo es un péptido mimético.

Anticuerpos diseñados racionalmente.

Campo técnico La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpo y a péptidos biológicamente activos como reactivos diagnósticos y terapéuticos.

Antecedentes de la técnica relacionada Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B y constituyen una defensa frente a las infecciones. Los anticuerpos se producen en millones de formas, cada una de las cuales presenta una secuencia aminoácida diferente. Las moléculas de anticuerpo están compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y de dos cadenas pesadas idénticas. Cuando se digieren con el enzima papaína, se generan dos fragmentos Fab idénticos junto con un fragmento Fc. Cuando se digieren con el enzima pepsina, se produce un fragmento F (ab') 2. Las cadenas ligeras y pesadas constan de regiones constantes y de regiones variables. Dentro de las regiones variables existen regiones hipervariables (también conocidas como regiones determinantes de complementariedad (CDR) ) que forman el sitio de unión al antígeno. Las partes restantes de las regiones variables se denominan regiones de marco.

Algunas funciones biológicas importantes, tales como la unión de receptores, la activación y la actividad enzimática, con frecuencia pueden atribuirse a regiones discretas de moléculas de proteína más grandes, que comprenden un número limitado de residuos aminoácidos. También se han descubierto péptidos que muestran actividades de unión, de activación o enzimáticas mediante el cribado de bibliotecas de péptidos generadas mediante la unión aleatoria de residuos aminoácidos. Estos péptidos pueden no corresponder a una disposición lineal de los aminoácidos en una molécula de proteína más grande que muestra una actividad biológica similar y se hace referencia a ellos como epítopos o mimótopos peptídicos discontinuos. Se han descrito y clonado determinados péptidos miméticos. Ver, por ejemplo, la patente US nº 6.083.913 (mimético de la trombopoyetina (TPO) ) , la patente US nº 5.835.382 (mimético de la eritropoyetina (EPO) ) , la patente US nº 5.830.851 (mimético de la EPO) y Wrighton et al., Science 273:458-63, (1996) . Los epítopos y mimótopo de péptidos, debido a sus dimensiones reducidas resultan potencialmente ventajosos respecto a las moléculas de proteína de gran tamaño para la utilización como reactivos terapéuticos. Sin embargo, los resultados con estos péptidos como compuestos terapéuticos con frecuencia pueden resultar insatisfactorios. Una desventaja de la utilización de los péptidos como reactivos terapéuticos es que generalmente son inestables in vivo, es decir, sus tasas de eliminación del suero pueden ser bastante rápidas. Además, resulta difícil predecir la actividad, terapéutica u otra, de un péptido si se fusiona con una molécula mayor debido a que los cambios de conformación y otras fuerzas moleculares pueden interferir con la actividad del péptido o bloquearla totalmente.

Se han llevado a cabo intentos para introducir determinados polipéptidos en regiones CDR de los anticuerpos. Ver, por ejemplo, la solicitud PCT WO 94/18221. Sin embargo, tal como se ha indicado anteriormente, debido a los cambios de conformación que pueden provocar los aminoácidos flanqueantes, la actividad biológica de los polipéptidos activos puede resultar disminuida o anulada. Por lo tanto, un objetivo en la presente memoria consiste en proporcionar anticuerpos diseñados racionalmente, o fragmentos de los mismos, que incluyan péptidos biológicamente activos para la utilización como reactivos diagnósticos y terapéuticos.

El documento WO 99/45110 da a conocer la sustitución de las estructuras en bucle CDR en el interior de los dominios similares a V de los ligandos no de anticuerpo tales como CTLA-4.

Sumario Se proporcionan en la presente memoria anticuerpos recombinantes biológicamente activos y sus fragmentos que imitan la actividad de los péptidos biológicamente activos, procedimientos para preparar estos anticuerpos y procedimientos para su utilización en la terapia y el diagnóstico. Estos anticuerpos y fragmentos de los mismos no adolecen de algunas de las desventajas de los péptidos aislados, debido a que los anticuerpos presentan naturalmente vidas medias séricas prolongadas y son altamente específicos en la unión a su diana. Inesperadamente se ha descubierto que la incorporación de aminoácidos particulares flanqueando un péptido diana que se ha insertado en una molécula de anticuerpo incrementa finalmente la actividad biológica del péptido.

Los anticuerpos o sus fragmentos presentan un péptido de interés insertado en una región determinante de complementariedad (CDR) de una molécula de anticuerpo. La molécula de anticuerpo sirve como estructura para la presentación del péptido y proporciona al péptido una mayor estabilidad. El péptido sustituye opcionalmente todos los aminoácidos de una región CDR, o puede añadirse a una CDR existente, de manera que se altere la especificidad del antígeno original, de manera que la región CDR se define mediante cualquiera de los dos esquemas aceptados (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologics Interest, 5ª edición (1991) , NIH Publication 91-3242, y Chothia et al., J. Mol. Bio. (227) :776-98, (1992) ) . Además, pueden introducirse aleatoriamente aminoácidos adicionales flanqueando el péptido y que permitan el cribado para una presentación óptima del péptido

en el marco del anticuerpo. Inesperadamente se ha descubierto que en determinados casos una prolina que flanquee el péptido da lugar a un incremento de la actividad biológica.

En formas de realización particulares, una molécula de anticuerpo o fragmento presenta residuos aminoácidos que corresponden a una región determinante de complementariedad (CDR) que han sido sustituidos por residuos aminoácidos que comprenden un péptido trombopoyético biológicamente activo. En otra forma de realización particular, los residuos aminoácidos que corresponden a por lo menos dos regiones determinantes de complementariedad (CDR) han sido, cada una de ellas, sustituidas por residuos aminoácidos que comprenden dicho péptido biológicamente activo. En una sola molécula de anticuerpo o su fragmento pueden sustituirse una o más regiones determinantes de complementariedad por un péptido; por ejemplo, CDR3 de una cadena pesada, CDR3 de una cadena ligera, CDR3 de una cadena pesada y de una cadena ligera, CDR2 y CDR3 de una cadena pesada, o CDR2 y CDR3 de una cadena ligera. Resultan posibles otras combinaciones de sustituciones de regiones CDR, incluyendo la sustitución de CDR1. Además, en lugar de sustituir una CDR, podría añadirse el péptido a una CDR nativa sin sustituir de hecho ningún residuo aminoácido y todavía alterar la especificidad original de antígeno.

De esta manera, en un aspecto se proporciona un péptido biológicamente activo con actividad mejorada mediante la adición de una prolina en su extremo carboxi con el fin de formar un péptido biológicamente activo extendido con prolina que se utiliza para sustituir o añadir por lo menos una parte de por lo menos una región CDR en una molécula de anticuerpo o su fragmento. En otro aspecto, se proporciona una molécula de anticuerpo o su fragmento que presenta un péptido mimético de TPO como sustitución para por lo menos una región CDR nativa. En este aspecto, el péptido mimético de TPO puede extenderse opcionalmente con prolina, tal como se describe en la presente memoria.

En las formas de realización particulares adicionales, la molécula de anticuerpo o su fragmento es un Fab, un ScFv, una región variable de cadena pesada, una cadena ligera o una molécula completa de IgG. La molécula de anticuerpo o su fragmento también puede presentar un dominio de dimerización, de manera que permita que las moléculas de anticuerpo en las que únicamente una CDR ha sido sustituida por un péptido, se dimericen y de esta manera activen los receptores que requieren la dimerización para su activación.

En determinadas formas de realización, el péptido biológicamente activo puede ser un epítopo de péptido lineal o un epítopo de péptido discontinuo. Además, el péptido biológicamente activo, cuando se sustituye por una región CDR, puede presentar, además de la prolina, dos o más residuos aminoácidos flanqueantes adicionales en posición proximal a los extremo aminoterminal y/o carboxi-terminal del péptido, que se sitúan entre el péptido y los residuos de la región marco de la inmunoglobulina (es decir, en lo que anteriormente era la unión entre la CDR y el marco contiguo) . Los residuos aminoácidos flanqueantes... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo o fragmento del mismo, en el que dicho fragmento comprende un Fab, un F (ab') 2, un scFv, un Fv, una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera de dicho anticuerpo, que comprende una región i) en la que los residuos aminoácidos que corresponden a por lo menos una parte de un región determinante de complementariedad (CDR) se sustituyen por un péptido biológicamente activo, o ii) en la que un péptido biológicamente activo es insertado en una CDR, en el que el péptido biológicamente activo es un péptido mimético.

2. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que el péptido biológicamente activo es un 10 péptido mimético agonista.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende además por lo menos una secuencia flanqueante que comprende por lo menos un aminoácido que está unido covalentemente a por lo menos un extremo del péptido biológicamente activo.

4. Anticuerpo según la reivindicación 3, en el que dicha por lo menos una secuencia flanqueante comprende una prolina que está unida covalentemente al péptido biológicamente activo.

5. Anticuerpo según la reivindicación 4, en el que la prolina está unida covalentemente al extremo carboxi-terminal 20 del péptido biológicamente activo.

6. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que por lo menos dos regiones determinantes de complementariedad (CDR) están cada una sustituidas con el péptido biológicamente activo.

7. Anticuerpo o fragmento del mismo según las reivindicaciones 1 a 6, en el que el péptido biológicamente activo se encuentra flanqueado en su extremo carboxi-terminal por una secuencia aminoácida seleccionada de entre el grupo constituido por prolina-valina, prolina-ácido aspártico, prolina-isoleucina, serina-asparagina, serina-lisina, serinaglicina, serina-arginina, leucina-histidina, leucina-ácido glutámico, leucina-alanina, leucina-fenilalanina, valinaglutamina, valina-serina, valina-alanina, valina-asparagina, isoleucina-serina, isoleucina-tirosina, asparagina-prolina, asparagina-serina, asparagina-triptófano, asparagina-valina, fenilalanina-valina, treonina-serina, metionina-alanina, arginina-serina, arginina-glicina, arginina-treonina, arginina-leucina, arginina-valina, triptófano-arginina, triptófanotriptófano, alanina-arginina, ácido aspártico-valina, glicina-tirosina, glutamina-arginina y glicina-lisina.

8. Anticuerpo o fragmento del mismo según las reivindicaciones 1 a 6, en el que el péptido biológicamente activo se encuentra flanqueado en su extremo amino-terminal por una secuencia aminoácida seleccionada de entre el grupo constituido por triptófano-leucina, valina-valina, glicina-prolina, leucina-prolina, leucina-tirosina, serina-leucina, serina-isoleucina, serina-prolina, treonina-metionina, treonina-tirosina, treonina-prolina, glutamina-treonina, glutamina-ácido glutámico, glutamina-leucina, arginina-metionina, arginina-asparagina, arginina-treonina, argininaglicina, arginina-serina, lisina-ácido glutámico, lisina-glicina, alanina-histidina, histidina-glicina, histidina-leucina y asparagina-prolina.

9. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que el fragmento de anticuerpo es seleccionado de entre el grupo constituido por fragmento Fab, fragmento F (ab') 2 y fragmento scFv.

45 10. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es una molécula de IgG completa.

11. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo es humano. 50

12. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo es el toxoide antitetánico.

13. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que la CDR se encuentra situada en una 55 cadena ligera.

14. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que la CDR se encuentra situada en una cadena pesada.

60 15. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que los residuos aminoácidos que corresponden a una parte de más de una CDR son sustituidos.

16. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que las regiones CDR3 de una cadena pesada y una cadena ligera están cada una sustituidas con el péptido mimético. 65

17. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que la CDR es seleccionada de entre el grupo constituido por una CDR3 de una cadena pesada y una CDR2 de una cadena ligera.

18. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que la CDR es seleccionada de entre el grupo 5 constituido por la CDR3 de una cadena pesada y la CDR2 de una cadena pesada.

19. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que la CDR es seleccionada de entre el grupo constituido por la CDR3 de una cadena pesada y la CDR1 de una cadena ligera.

20. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, en el que la CDR comprende la CDR2 y la CDR3.

21. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 20, en el que la CDR se encuentra situada en una cadena pesada.

22. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 20, en el que la CDR se encuentra situada en una cadena ligera.

23. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 6, en el que dichas por lo menos dos CDR son seleccionadas de entre el grupo constituido por CDR3 de cadena pesada y CDR2 de cadena pesada, CDR3 de cadena pesada y CDR2 de cadena ligera, CDR2 de cadena pesada y CDR2 de cadena ligera, CDR3 de cadena pesada y CDR2 de cadena pesada y CDR2 de cadena ligera, y CDR3 de cadena pesada y CDR1 de cadena ligera.

24. Ícido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1.

25. Vector de expresión que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 24.

26. Célula huésped transformada con el vector de expresión según la reivindicación 25.

27. Procedimiento de producción de un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende cultivar una célula

huésped según la reivindicación 26 en unas condiciones adecuadas para la expresión de la inmunoglobulina o su fragmento.

28. Composición que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable. 35

29. Procedimiento de manipulación por ingeniería genética de un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1, que comprende:

proporcionar un ácido nucleico que codifica un anticuerpo;

sustituir por lo menos una parte de por lo menos una región codificante de CDR con ácido nucleico que codifica un péptido biológicamente activo, o insertar el ácido nucleico que codifica un péptido biológicamente activo en por lo menos una región codificante de CDR, en el que el péptido biológicamente activo es un péptido mimético; y

45 expresar el péptido codificado por el constructo de ácido nucleico junto con una cadena de anticuerpo seleccionada de entre el grupo constituido por cadena pesada y cadena ligera, en una célula huésped adecuada de manera que es formado un heterodímero.

30. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que el péptido biológicamente activo comprende una prolina 50 unida de manera covalente a un extremo carboxi-terminal del péptido biológicamente activo.

31. Biblioteca que contiene anticuerpos variados o fragmentos de los mismos según la reivindicación 1, presentando el péptido biológicamente activo por lo menos una secuencia flanqueante que ha sido aleatorizada para generar anticuerpos o fragmentos de los mismos que presentan unas secuencias aminoácidas variables.