Anticuerpos contra el factor de crecimiento nervioso (NGF) con estabilidad in vivo mejorada.

Un anticuerpo anti-factor de crecimiento nervioso (NGF) que comprende:

(i) una región variable de cadena pesada que comprende las CDR 1, 2 y 3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente,

(ii) una región variable de cadena ligera que comprende las CDR 1, 2 y 3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, y

(iii) una región constante de IgG4 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Anticuerpos contra el factor de crecimiento nervioso (NGF) con estabilidad in vivo mejorada

Antecedentes de la invención [0001] El factor de crecimiento nervioso (NGF) es una proteína secretada que fue descubierta hace 50 años como una molécula que promueve la supervivencia y diferenciación de las neuronas sensoriales y simpáticas. La cadena beta del NGF es responsable en exclusiva de la actividad de estimulación del crecimiento nervioso del NGF. 10 La cadena beta se homodimeriza y se incorpora en un complejo proteínico mayor. El NGF es un miembro de una familia de factores neurotróficos conocidos como neurotrofinas. El NGF se une con alta afinidad a un receptor de tropomiosina-cinasa conocido como TrkA. El NGF es también capaz de unirse a un receptor conocido como p75NTR , un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, que también interacciona con otras neurotrofinas. La estructura y función del NGF es revisada, por ejemplo, en Sofroniew, M.V. y col. (2001) Annu. Rev.

Neurosci. 24: 1217-1281; Weismann, C. y de Vos, A.M. (2001) Cell. Mol. Life Sci. 58: 748-759; Fahnestock, M. (1991) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 165: 1-26.

Aunque el NGF se identificó originalmente por su capacidad para promover la supervivencia y diferenciación de las neuronas, existe una evidencia creciente que indica que estos efectos en el desarrollo son sólo 20 un aspecto de la biología del NGF. En particular, el NGF se ha relacionado con la transmisión y el mantenimiento de dolor crónico o persistente. Por ejemplo, se ha demostrado que la administración local y sistémica de NGF provoca hiperalgesia y alodinia (Lewin, G.R. y col. (1994) Eur. J. Neurosci. 6: 1903-1912) . La infusión intravenosa de NGF en seres humanos produce una mialgia en todo el cuerpo mientras que la administración local evoca hiperalgesia y alodinia en el sitio de inyección además de los efectos sistémicos (Apfel, S.C. y col. (1998) Neurology 51: 695-702) .

Además, en algunas formas de cáncer, el exceso de NGF facilita el crecimiento e infiltración de las fibras nerviosas con inducción de dolor por cáncer (Zhu, Z. y col. (1999) J. Clin. Oncol. 17: 241-228) .

La intervención del NGF en el dolor crónico ha conducido a un interés considerable en los enfoques terapéuticos basados en la inhibición de los efectos del NGF (véase por ejemplo, Saragovi, H.U. y Gehring, K. (2000)

Trends Pharmacol. Sci. 21: 93-98) . Por ejemplo, se usó una forma soluble del receptor TrkA para bloquear la actividad del NGF, lo que según se demostró reduce significativamente la formación de neuromas, responsables de dolor neuropático, sin dañar los cuerpos celulares de las neuronas lesionadas (Kr y ger, G.S. y col. (2001) J. Hand Surg. (Am.) 26: 635-644) .

Otro enfoque para neutralizar la actividad del NGF consiste en el uso de anticuerpos anti-NGF, anticuerpos de los se han descrito algunos ejemplos (véase por ejemplo, las publicaciones PCT nº WO-2001/78.698, WO-2001/64.247, WO-2002/096.458, WO-2004/032.870, WO-2005/061.540, WO-2006/131.951, WO-2006/110.883, la patente de EE.UU. nº 7.449.616; las publicaciones de EE.UU. nº US-2005/0.074.821, US-2008/0.033.157, US2008/0.182.978 y US-2009/0.041.717) . En modelos de animales de dolor neuropático (por ejemplo, ligadura del

nervio raquídeo o del tronco del nervio) la inyección sistémica de anticuerpos de neutralización para NGF previene la alodinia y la hiperalgesia (Ramer, M.S. y Bisby, M.A. (1999) Eur. J. Neurosci. 11: 837-846; Ro, L.S. y col. (1999) Pain 79: 265-274) . Además, el tratamiento con un anticuerpo anti-NGF de neutralización produce una reducción significativa del dolor en un modelo de dolor de cáncer murino (Sevcik, M.A. y col. (2005) Pain 115: 128-141) .

El documento WO-2009/023.540 describe anticuerpos humanos para factor de crecimiento nervioso humano.

El documento WO-2006/131.951 describe moléculas que son capaces de inhibir la unión entre el NGF y el receptor TrkA como analgésico con efecto prolongado.

Así, a la vista de lo anterior, son deseables antagonistas de NGF adicionales.

Resumen de la invención 55 [0008] La presente invención proporciona anticuerpos anti-NGF tal como se define en las reivindicaciones que muestran estabilidad in vivo mejorada. En particular, la invención proporciona un anticuerpo anti-NGF que comprende una región constante de IgG4 humana, en el que la región constante de IgG4 humana comprende una mutación de región bisagra tal como se define en las reivindicaciones y en el que el anticuerpo muestra una larga semivida de eliminación terminal, por ejemplo una semivida de eliminación terminal en un mono cynomolgus de al

menos 15 días y normalmente en el intervalo de aproximadamente 15 a aproximadamente 22 días (o un intervalo de 15 días a 22 días) , o en un intervalo de aproximadamente 15 días a 28 días (o en un intervalo de 15 días a 28 días) ,

o en un intervalo de aproximadamente 21 días a aproximadamente 28 días (o en un intervalo de 21 días a 28 días) . Este anticuerpo anti-NGF estabilizado (anticuerpo estabilizado en bisagra) también muestra una semivida de 5 eliminación terminal en ratas de al menos 8 días, normalmente en el intervalo de aproximadamente 8 a aproximadamente 9 días (o en el intervalo de 8 a 9 días) . En otras realizaciones más, el anticuerpo anti-NGF estabilizado (anticuerpo estabilizado en bisagra) puede mostrar una semivida de eliminación terminal media en seres humanos de al menos 10-30 días, o al menos 10 días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 30 días o en un intervalo de aproximadamente 10 días a aproximadamente 40 días o en un intervalo de 10 aproximadamente 15 días a aproximadamente 30 días (o en un intervalo de 10 a 40 días o en un intervalo de 15 a 30 días) . En otras realizaciones más, el anticuerpo anti-NGF estabilizado (anticuerpo estabilizado en bisagra) puede mostrar una semivida farmacológica media en seres humanos de al menos 30 días, o al menos 35 días, o al menos 40 días, o en un intervalo de al menos cuatro a seis semanas (o en un intervalo de cuatro a seis semanas) , o en un intervalo de al menos cuatro a siete semanas (o en un intervalo de cuatro a siete semanas) o en un intervalo de al

menos cuatro a ocho semanas (o en un intervalo de cuatro a ocho semanas) .

La mutación en la región constante de IgG4 es una mutación de región bisagra. La mutación de región bisagra en la región constante de IgG4 comprende la mutación de la serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 108 de SEQ ID NO: 9 (que muestra la secuencia de aminoácidos 20 natural de la región constante de IgG4 humana) . En consecuencia, el anticuerpo anti-factor de crecimiento nervioso (NGF) tiene una región constante de IgG4 humana, conteniendo dicha región constante de IgG4 humana una mutación de región bisagra que comprende la mutación de serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 108 de SEQ ID NO: 9. La serina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 108 de SEQ ID NO: 9 se muta a prolina. La región constante de IgG4 humana del anticuerpo anti

NGF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. En la presente memoria descriptiva se describen otras mutaciones de estabilización de la IgG4.

Un anticuerpo anti-NGF preferido de la invención es el anticuerpo PG110, la secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en SEQ ID NO: 13 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera 30 que se muestra en SEQ ID NO: 16. En consecuencia, la invención proporciona un anticuerpo anti-NGF tal como se define en las reivindicaciones que comprende una región constante de IgG4 humana, en la que el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. La memoria descriptiva describe un anticuerpo anti-NGF que comprende una región constante de IgG4 humana, en la que el anticuerpo comprende una cadena 35 pesada codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 14. La memoria descriptiva describe un anticuerpo anti-NGF que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, en el que el anticuerpo tiene una semivida de eliminación terminal en un mono cynomolgus de al menos 15 días (y normalmente en el intervalo de aproximadamente 15 a aproximadamente 22 días, o en un intervalo de 15 a 22 días, o en un 40 intervalo de aproximadamente 15 días a 28 días, o en un intervalo de 15 a 28 días, o en un intervalo... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-factor de crecimiento nervioso (NGF) que comprende:

(i) una región variable de cadena pesada que comprende las CDR 1, 2 y 3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente,

(ii) una región variable de cadena ligera que comprende las CDR 1, 2 y 3 que tienen las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, y

(iii) una región constante de IgG4 humana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

2. El anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

3. El anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2 que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

4. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un anticuerpo humanizado.

5. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-NGF según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un soporte farmacéuticamente aceptable.

6. Un kit que comprende el anticuerpo anti-NGF según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Un ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. El ácido nucleico según la reivindicación 7 que codifica además la cadena ligera del anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

9. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 7 u 8.

10. El vector de expresión según la reivindicación 9 que comprende las SEQ ID NO: 11 y 14.

11. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión según la reivindicación 9 ó 10.

12. Un procedimiento de expresión de un anticuerpo anti-NGF según se define en la reivindicación 1 que comprende el cultivo de la célula hospedadora según la reivindicación 11.

13. Un anticuerpo anti-NGF según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en un procedimiento para el tratamiento del dolor.

14. Uso del anticuerpo anti-NGF según una de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor.

15. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 13, o el uso según la reivindicación 14, en el que el dolor es dolor por artrosis.

16. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 13, o el uso según la reivindicación 14, en el que el dolor es dolor lumbar crónico.