Anticuerpos biespecíficos trivalentes.

Anticuerpo biespecífico trivalente, que comprende

a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo,

b) un polipéptido que consiste de:

ba) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, o

bb) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, en el que dicho polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VH mediante un conector peptídico al extremo C-terminal de una de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa,

c) un polipéptido que consiste de:

ca) un dominio variable de cadena ligera (VL), o

cb) un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, en el que dicho polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VL mediante un conector peptídico al extremo C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa,

y en el que el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) del polipéptido de b) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) del polipéptido de c) forman conjuntamente un sitio de unión de antígeno que se une específicamente al segundo antígeno.

Anticuerpos biespecíficos trivalentes La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos trivalentes, a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y a usos de los mismos.

Antecedentes de la invención En el pasado reciente se ha desarrollado una amplia diversidad de formatos de anticuerpo recombinante multiespecífico, por ejemplo anticuerpos biespecíficos tetravalentes mediante la fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios de cadena sencilla (ver, por ejemplo, Coloma M.J. et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997, documento nº WO 2001/077342, y Morrison S.L., Nature Biotech. 25:1233-1234, 2007) .

Además, se han desarrollado varios otros formatos nuevos en los que ya no se retiene la estructura nuclear del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) , tales como diacuerpos, triacuerpos o tetracuerpos, minicuerpos, varios formatos de cadena sencilla (scFv, Bis-scFv) , que son capaces de unirse a dos o más antígenos (Holliger P. et al., Nature Biotech. 23:1126-1136, 2005; Fischer N. y Léger O., Pathobiology 74:3-14, 2007; Shen J. et al., Journal of Immunological Methods 318:65-74, 2007; Wu C. et al., Nature Biotech. 25:1290-1297, 2007) .

La totalidad de dichos formatos utiliza conectores para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a una proteína ligante adicional (por ejemplo scFv) o para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv (Fischer

N. y Léger O., Pathobiology 74:3-14, 2007) . Puede desearse la conservación de las funciones efectoras, tales como, por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , las cuales se encuentran mediadas por la unión de un receptor Fc, mediante el mantenimiento de un grado elevado de similitud con los anticuerpos naturales.

En el documento nº WO 2007/024715 se informa de inmunoglobulinas duales de dominio variable en forma de proteínas construidas ligantes multivalentes y multiespecíficas. Se informa de un procedimiento para la preparación de anticuerpos diméricos biológicamente activos en la patente US nº 6.897.044. Se informa de un constructo de anticuerpo Fv multivalente que presenta por lo menos cuatro dominios variables que se encuentran unidos entre sí mediante conectores peptídicos en la patente US nº 7.129.330. Se informa de estructuras de unión de antígeno diméricas y multiméricas en el documento nº US 2005/0079170. En la patente US nº 6.511.663 se informa de una proteína anterior de unión a antígeno monoespecífica tetravalente que comprende tres o cuatro fragmentos Fab unidos entre sí covalmentemente mediante una estructura de conexión, no siendo esta proteína una inmunoglobulina natural. En el documento nº WO 2006/020258 se informa de anticuerpos biespecíficos tetravalentes que pueden expresarse eficientemente en células procarióticas y eucarióticas, y que resultan útiles en métodos terapéuticos y diagnósticos. Se informa en el documento nº US 2005/0163782 de un método para la separación o la síntesis preferente de dímeros unidos mediante por lo menos un enlace disulfuro entre cadenas, a partir de dímeros que no se encuentran unidos por, como mínimo, un enlace disulfuro entre cadenas, en el que se parte de una mezcla que comprende los dos tipos de polipéptidos diméricos. Se informa de receptores tetravalentes biespecíficos en la patente US nº 5.959.083. Se informa de anticuerpos construidos con tres o más sitios de unión de antígeno funcionales en el documento nº WO 2001/077342.

Se informa de polipéptidos de unión a antígeno multiespecíficos y multivalentes en el documento nº WO 1997/001580. El documento nº WO 1992/004053 informa de homoconjugados, típicamente preparados a partir de anticuerpos monoclonales de la clase IgG que se unen al mismo determinante antigénico, unidos covalentemente mediante entrecruzamiento sintético. Se informa de anticuerpos monoclonales oligoméricos con elevada avidez para antígenos en el documento nº WO 1991/06305, en la que se secretan oligómeros, típicamente de la clase IgG, que presentan dos o más monómeros inmunoglobulina asociados entre sí formando moléculas de IgG tetravalentes o hexavalentes. Se informa de anticuerpos derivados de ovejas y constructos de anticuerpo manipulados en la patente US nº 6.350.860, que pueden utilizarse para tratar enfermedades en las que la actividad del interferón gamma resulta patogénica. En el documento nº US 2005/0100543 se informa de constructos potenciales dianas que son portadores multivalentes de anticuerpos biespecíficos, es decir, cada molécula de un constructo diana potencial puede servir como portador de dos o más anticuerpos biespecíficos. Se informa de anticuerpos tetravalentes biespecíficos genéticamente manipulados en el documento nº WO 1995/009917. En el documento WO nº 2007/109254 se informa de moléculas de unión estabilizadas que consisten o que comprenden un scFv estabilizado.

El documento nº WO 2009/018386 da a conocer un formato de anticuerpo biespecífico tetravalente en el que se encuentran fusionados dos scFv con los extremos C-terminales de un anticuerpo de longitud completa, y da a conocer además un formato de anticuerpo bivalente en el que se encuentran fusionados un dominio VH y un dominio VL con los dos extremos C-terminales de un fragmento Fab, respectivamente.

Descripción resumida de la invención Un primer aspecto de la presente invención es un anticuerpo biespecífico trivalente que comprende: a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo, b) un polipéptido que consiste de:

ba) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, o bb) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, y un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, en el que dicho polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VH mediante un conector peptídico al extremo C-terminal de una de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa,

c) un polipéptido que consiste de: ca) un dominio variable de cadena ligera (VL) , o cb) un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, en el que dicho polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VL mediante un conector peptídico al extremo C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa, y en el que el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) del polipéptido de b) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) del polipéptido de c) conjuntamente forman un sitio de unión de antígeno que se une específicamente a un segundo antígeno Un aspecto adicional de la invención es una molécula de ácidos nucleicos codificante de un anticuerpo biespecífico trivalente según la invención.

Son aspectos todavía adicionales de la invención una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo biespecífico trivalente.

Los anticuerpos biespecíficos trivalentes según la invención muestran, por una parte, nuevas propiedades debido a su unión a diferentes antígenos, y por otra parte, resultan adecuados para la producción y formulación farmacéutica debido a su estabilidad, agregación reducida y propiedades farmacocinéticas y biológicas. Debido a su núcleo de Ig todavía conservan las propiedades de los anticuerpos naturales tales como ADCC y CDC.

Descripción detallada de la invención Un aspecto de la invención es un anticuerpo biespecífico trivalente que comprende: a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo, b) un polipéptido que consiste de:

ba) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, obb) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, en el que dicho polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VH mediante un conector peptídico al extremo C-terminal de una de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa,

c) un polipéptido que consiste de: ca) un dominio variable de cadena ligera (VL) , o cb) un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, en el que dicho polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VL mediante un conector peptídico al extremo C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa, y en el que el dominio variable de cadena... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo biespecífico trivalente, que comprende

a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a un primer antígeno y que consiste de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo, b) un polipéptido que consiste de: ba) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, o bb) un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo y un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, en el que dicho polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VH mediante un conector peptídico al extremo C-terminal de una de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa, c) un polipéptido que consiste de: ca) un dominio variable de cadena ligera (VL) , o cb) un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, en el que dicho polipéptido se encuentra fusionado con el extremo N-terminal del dominio VL mediante un conector peptídico al extremo C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas de dicho anticuerpo de longitud completa, y en el que el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) del polipéptido de b) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) del polipéptido de c) forman conjuntamente un sitio de unión de antígeno que se une específicamente al segundo antígeno.

2. Anticuerpo biespecífico trivalente según la reivindicación 1, caracterizado por que el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cada pesada se reúnen, cada uno, en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 de anticuerpo, en el que dicha interfaz se altera para estimular la formación del anticuerpo biespecífico trivalente, en el que la alteración se caracteriza por que: i) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada de manera que, dentro de la interfaz original, el dominio CH3 de una cadena pesada que se reúne con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena pesada en el anticuerpo biespecífico trivalente, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido que presenta un volumen de cadena lateral mayor, generando de esta manera una protuberancia dentro de la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada que es posicionable en una cavidad dentro de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada, y ii) el dominio CH3 de la otra cadena pesada ha sido alterado, de manera que dentro de la interfaz original del segundo dominio CH3 que se reúne con la interfaz original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespecífico trivalente, se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido de volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una cavidad en el interior de la interfaz del segundo dominio CH3, en el interior de la cual puede situarse una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3.

3. Anticuerpo biespecífico trivalente según la reivindicación 2, caracterizado por que: i) dicho residuo aminoácido que presenta un volumen más grande de cadena lateral se selecciona de entre el grupo que consiste de arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) , triptófano (W) , y ii) dicho residuo aminoácido que presenta un volumen más pequeño de cadena lateral se selecciona de entre el grupo que consiste de alanina (A) , serina (S) , treonina (T) y valina (V) .

4. Anticuerpo biespecífico trivalente según la reivindicación 2 o 3, caracterizado por que: ambos dominios CH3 se han alterado adicionalmente mediante la introducción de cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de manera que puede formarse un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.

5. Anticuerpo biespecífico trivalente según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado por que: el dominio CH3 en i) comprende una mutación T366W, y el dominio CH3 en ii) comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V.

6. Anticuerpo biespecífico trivalente según la reivindicación 4, caracterizado por que el dominio CH3 en i) comprende las mutaciones Y349C y T366W, y el dominio CH3 en ii) comprende las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V.

7. Anticuerpo biespecífico trivalente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que el dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido de b) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido de c) se unen y estabilizan mediante un puente disulfuro entre cadenas mediante la introducción de un enlace disulfuro entre las posiciones siguientes: i) posición 44 del dominio variable de cadena pesada a posición 100 del dominio variable de cadena ligera, ii) posición 105 del dominio variable de cadena pesada a la posición 43 del dominio variable de cadena ligera, o

iii) entre la posición 101 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera.

8. Anticuerpo biespecífico trivalente según la reivindicación 7, caracterizado por que el dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo del polipéptido de b) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo del polipéptido de c) se unen y estabilizan mediante un puente disulfuro entre cadenas mediante la introducción de un enlace disulfuro entre las posiciones siguientes: i) la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera.

9. Anticuerpo biespecífico trivalente según la reivindicación 6, caracterizado por que los conectores peptídicos de b) y c) son péptidos idénticos que presentan una longitud comprendida entre 25 y 50 aminoácidos.

10. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico trivalente según las reivindicaciones 1 a 9.

11. Ácido nucleico codificante de un anticuerpo biespecífico trivalente según las reivindicaciones 1 a 9.