ANTICUERPOS ANTIIDIOTÍPICOS CONTRA UN INHIBIDOR DEL FACTOR VIII Y USOS DE LOS MISMOS.

Anticuerpos antiidiotípicos contra un inhibidor del factor VIII y usos de los mismos. Campo de la invención La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de la hemofilia, especialmente para usar en el tratamiento de pacientes humanos que han desarrollado inhibidores del FVIII dirigidos contra el dominio C2. La presente invención proporciona anticuerpos antiidiotípicos contra los inhibidores del FVIII dirigidos contra el dominio C2. La presente invención se refiere además a líneas celulares monoclonales que expresan dichos anticuerpos antiidiotípicos. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas, que comprenden los anticuerpos antiidiotípicos de la presente invención. Antecedentes de la invención ES 2 366 280 T3 La hemofilia A es un trastorno ligado al cromosoma X que se caracteriza por la ausencia o una cantidad insuficiente del factor VIII funcional, una molécula glicoproteica de 330 kD producida por el hígado en forma de una cadena polipeptídica sencilla de 2332 aminoácidos. Esta deficiencia afecta a 1 por cada 10.000 varones y puede dar lugar a una hemorragia incontrolada en articulaciones, músculos y tejidos blandos. Los pacientes afectados por la forma más grave de la enfermedad (Actividad del FVIII menor del 1% del nivel normal) sufren hemorragias espontáneas. Los pacientes con la correspondiente actividad del FVIII de 1 al 5% o superior al 5% se definen como hemofilia A moderada o leve, respectivamente, y sufren hemorragia limitada que se produce tras un traumatismo o una cirugía menores. La vía de la coagulación se puede restablecer mediante la administración de concentrados de FVIII preparados a partir de plasma o producidos mediante tecnología de ADNc recombinante. El gen humano del FVIII se ha aislado y expresado en células de mamífero, tal como han indicado varios autores, incluidos Wood y col., en Nature (1984) 312: 330-337 y la secuencia de aminoácidos se dedujo a partir de ADNc. La patente de EE.UU. nº 4.965.199 divulga un procedimiento de ADN recombinante para producir FVIII en células huésped de mamífero y purificación de FVIII humano. La estructura detallada del FVIII humano se ha investigado extensamente. La secuencia nucleotídica del ADNc que codifica el FVIII humano y la secuencia de aminoácidos predicha se han divulgado en, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5663.060. En una molécula de FVIII, un dominio se puede definir como una secuencia continua de aminoácidos que se define por una homología de la secuencia de aminoácidos interna y sitios de escisión proteolítica por una proteasa adecuada como, por ejemplo, la trombina. Se ha descrito que las proteínas de FVIII constan de diferentes dominios que, para la secuencia de aminoácidos humana corresponden a: A1, residuos 1-372; A2, residuos 373-740; B, residuos 741-1648; A3, residuos 1690-2019; C1, residuos 2020-2172; C2, residuos 2173-2332. La secuencia restante, los residuos 1649-1689, normalmente se denominan el péptido de activación de la cadena ligera de FVIII. El FVIII se produce como una cadena polipeptídica sencilla que, tras el procesamiento en el interior de la célula, se escinde rápidamente tras su secreción para formar un heterodímero formado por una cadena pesada que contienen los dominios A1, A2 y 8, y una cadena ligera formada por los dominios A3-C1-C2, de acuerdo con Kaufman y col., (1988, J BioI Chem 263:6352-6362). Las dos cadenas están unidas de forma no covalente por cationes divalentes. Tanto el polipéptido monocatenario como el heterodímero circulan en plasma como precursores inactivos, como indican Ganz y col., (1988, Eur J Biochem 170:521-528). La activación del factor VIII en plasma inicia la escisión por la trombina entre los dominios A2 y B, que libera el dominio B y tiene como resultado una cadena pesada compuesta por los dominios A1 y A2, de acuerdo con Eaton y col., (1986, Biochemistry 25:505-512). El FVIII recombinante humano puede producirse mediante recombinación genética en células de mamífero, tal como células CHO (células de hámster chino), células BHK (células de riñón de hámster neonato) u otras células equivalentes. Pratt y col., (1999, Nature 402:439-42) divulgan la estructura detallada del dominio C2 carboxi-terminal del FVIII humano, que contiene sitios que son esenciales para su union al factor von Willebrand (vWF) y a superficies de fosfolípidos cargados negativamente. Esta estructura, que revela un núcleo beta-sándwich dos vueltas beta y un bucle exhibe un grupo del disolvente expuesto a residuos hidrofóbicos, explica parcialmente las mutaciones en la región C2 que condujeron a trastornos hemorrágicos en la hemofilia A. De acuerdo con Gale y col., (2000, Thromb. Haemost. 83:78-85), de las al menos 250 mutaciones de sentido erróneo que producen deficiencia de FVIII y hemofilia A, 34 en los dominios C. El FVIII es un cofactor de la vía intrínseca de la cascada de coagulación, que actúa incrementando la actividad proteolítica del factor IX activado sobre el factor X, en la formación del denominado complejo de tenasa. Los pacientes que sufren hemofilia A presentan hemorragias que son espontáneas en las formas más graves de la enfermedad o que se producen tras traumatismos en las formas leves/moderadas. Los pacientes de hemofilia normalmente son tratadas mediante terapia de sustitución, que consiste en infundir factor FVIII humano, bien purificado de reservas de plasma de donante o bien obtenido mediante tecnología de recombinación de ADNc. La mayoría de los pacientes no responden inmunológicamente a estas infusiones, peor por motivos que todavía no están claros, en el 25% de ellos se produce una respuesta inmunitaria de tipo IgG frente al FVIII, que puede temer como resultado la inhibición completa de la actividad procoagulación del FVIII infundido (Briet E y col., en (1994) 2 ES 2 366 280 T3 Throm. Haemost.; 72: 162-164; Ehrenforth S y col., en (1992) Lancet; 339:594). Dicha IgG específica, que pertenece a las subclases 1, 2, 4 de IgG, se denomina inhibidores de FVIII. Los estudios publicados han demostrado que la respuesta inmunitaria anti-FVIII es policlonal y dirigida principalmente hacia los dominios A2, A3 y C2 (Scandella D y col., en (1989) Blood; 74: 1618-1626.; Gilles JG y col., en (1993) Blood; 82: 2452 2461). Estudios recientes que usan anticuerpos monoclonales humanos derivados del repertorio de células B memoria periféricas de pacientes con inhibidores indicaron que epítopos importantes también se localizan en el dominio C1 (Jacquemin M y col., en (2000) Blood 95:156-163). El mecanismo por el cual los anticuerpos anti-FVIII interfieren en la función de FVII son numerosos, e incluyen escisión proteolítica del FVIII y la interacción con diferentes parejas, tales como el factor de von Willebrand factor (vWF), fosfolípidos (FL), FIX, FXa o APC. La mayoría de estos mecanismos se describen bien en estudios que usan anticuerpos anti-FVIII de ratón o de ser humano. Por tanto, los anticuerpos pueden reducir la velocidad a la que el FVIII se activa uniéndose a un sitio de escisión proteolítica o induciendo un cambio conformacional 3D en el FVIII de modo que sea menos susceptible a proteólisis. Los anticuerpos que interfieren en la unión de vWF a FVIII parecen ser muy eficientes como inhibidores, como se muestra en estudios recientes usando anticuerpos monoclonales humanos dirigidos hacia el dominio C2, que es uno de los sitios de union principales del vWF (Jacquemin M y col.,en (1998) Blood; 92:496501). La supresión de la producción de inhibidores y el establecimiento de un estado de falta de respuesta inmunitaria al FVIII sigue siendo un objetivo principal. No obstante, la comunidad médica está lejos de alcanzar estos objetivos, debido, básicamente, a la limitada comprensión de los mecanismos subyacentes a la producción y regulación de anticuerpos específicos. Actualmente, para controlar dicha respuesta inmunitaria, se usan varios tratamientos, que incluyen agentes de cortocircuito tales como desmopresina (DDAVP), agentes estimulantes de la coagulación, tales como concentrados del complejo de protrombina (PCC) o PCC activado, FVIIa recombinante, plasmaféresis e infusiones de dosis grandes o intermedias de FVIII (200-300 UI/kg de peso corporal o 25-50 UI/kg de peso corporal, respectivamente). No obstante, ninguno de estos procedimientos son satisfactorios y todos ellos son muy costosos. En función de estas observaciones y de la comprensión de los mecanismos de tolerancia inmunitaria, los anticuerpos antiidiotípicos parecen ser un prometedor modo de tratar los inhibidores. De hecho, está bien establecido que la tolerancia a las autoproteínas se induce primero en un estadio precoz mediante deleción clonal de células B y células T autorreactivas en la médula ósea y el timo, respectivamente. No obstante, no todos los linfocitos... 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1. Anticuerpo monoclonal antiidiotípico contra un anticuerpo inhibidor del Factor VIII humano, estando dicho anticuerpo inhibidor dirigido contra el dominio C2 del Factor VIII, que se caracteriza por el hecho de que las regiones determinantes de complementariedad de las cadenas pesadas variables de dicho anticuerpo antiidiotípico tienen las secuencias de aminoácidos representadas en la SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 7, y las regiones determinantes de complementariedad de las cadenas ligeras variables de dicho anticuerpo antiidiotípico tienen las secuencias de aminoácidos representadas en la SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 9 y SEC ID Nº 10, y por el hecho de que el anticuerpo antiidiotípico a) neutraliza la actividad anti-coagulante de dicho anticuerpo inhibidor del factor VIII humano en al menos un 50% en un ensayo cromogénico de FVIII y b) no interfiere en la unión de FVIII a vWF y fosfolípidos. 2. El anticuerpo antiidiotípico según la reivindicación 1, en el que la cadena pesada variable de dicho anticuerpo antiidiotípico está codificado por la secuencia nucleotídica representada en la SEC Nº 1 o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95% con la SEC ID Nº 1, o en el que la cadena ligera variable del anticuerpo antiidiotípico está codificado por la secuencia nucleotídica representada en la SEC Nº 3 o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95% con la SEC ID Nº 3. 3. El anticuerpo antiidiotípico según la reivindicación 1, en el que la cadena pesada variable de dicho anticuerpo antiidiotípico está codificado por la secuencia nucleotídica representada en la SEC Nº 1 o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70% con la SEC ID Nº 1, y en el que la cadena ligera variable del anticuerpo antiidiotípico está codificada por la secuencia nucleotídica representada en la SEC Nº 3 o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70% con la SEC ID Nº 3. 4 El anticuerpo antiidiotípico monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un fragmento F(ab)2, un fragmento Fab, un fragmento Fab o una versión modificada de dicho fragmento. 5 El anticuerpo antiidiotípico monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un anticuerpo antiidiotípico monoclonal humanizado. 6 El anticuerpo antiidiotípico monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es 14C12 producido por la línea celular 14C12 depositada en la BCCM con el número de registro LMBP 5878CB o un fragmento de anticuerpo del mismo que contiene el sitio de unión al anticuerpo. 7 Una línea celular monoclonal que expresa un anticuerpo antiidiotípico monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 8 La línea celular monoclonal según la reivindicación 7, que es la línea celular 14C12 depositada en la BCCM con número de registro LMBP 5878CB. 9 Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo antiidiotípico monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, mezclado con al menos un transportador farmacéuticamente aceptable. 10 Uso de un anticuerpo antiidiotípico monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente con hemofilia que sufre hemorragia, o para la prevención de hemorragias en dicho paciente. 11 Uso de un anticuerpo antiidiotípico monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la hemorragia incontrolada en un paciente de hemofilia con anticuerpos inhibidores de FVIII. 12 La composición farmacéutica según la reivindicación 9, que además comprende FVIII. 13 Un procedimiento para desarrollar anticuerpos antiidiotípicos monoclonales para la fabricación de un medicamento contra inhibidores del FVIII, comprendiendo dicho procedimiento inmunizar un animal no humano con anticuerpos inhibidores dirigidos contra el dominio C2 del FVIII y cribar los esplenocitos INMORTALIZADOS DE DICHO ANIMAL Para la producción de anticuerpos que a) neutralizan la actividad anticoagulante de dichos anticuerpos inhibidores en al menos un 50% en un ensayo cromogénico de FVIII y b) no interfieren en la unión de FVIII a vWF y fosfolípidos. 14 Uso de los anticuerpos antiidiotípicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la detección o purificación in vitro de anticuerpos inhibidores de FVIII. 24 ES 2 366 280 T3 ES 2 366 280 T3 26 ES 2 366 280 T3 27 ES 2 366 280 T3 28 ES 2 366 280 T3 29 ES 2 366 280 T3 Figura 5 ES 2 366 280 T3 31 ES 2 366 280 T3 32 ES 2 366 280 T3 33 ES 2 366 280 T3 34