ANTICUERPOS ANTI-VEGF.

Anticuerpo anti-factor de crecimiento endotelial vascular humanizado para su uso en un ensayo de diagnóstico in vivo,

en donde el anticuerpo inhibe la sustituciones en al menos dos de dichos residuos de cadena pesada

Antecedentes de la invención Campo de la invención [0001] La presente invención hace referencia en general a anticuerpos anti-VEGF y, en particular, a anticuerpos anti-VEGF humanizados y variantes de los anticuerpos anti-VEGF. Descripción de la materia relacionada [0002] Actualmente está bien establecido que la angiogénesis está implicada en la patogénesis de una variedad de trastornos. Entre estos se incluyen los tumores sólidos, los síndromes neovasculares intraoculares tales como las retinopatías proliferativas o la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), la artritis reumatoide y la psoriasis (Folkman y col., J Biol Chem. 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun y col., Amm. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); y Garner A, Vascular diseases. In: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth Gk, Eds.

2nd

Edition Marcel Dekker, NY, pp 1625-1710 (1994)). En el caso de los tumores sólidos, la neovascularización permite que las células tumorales adquieran una ventaja en el crecimiento y una autonomía proliferativa en comparación con las células normales. En concordancia, se ha observado una correlación entre la densidad de los microvasos en secciones tumorales y la supervivencia del paciente en el cáncer de mama así como en otros muchos tumores (Weidner y col., N Engl J Med 324:1-6 (1991); Horak y col., Lancet 340:1120-1124 (1992); y Macchiarini y col., Lancet 340:145-146 (1992)). [0003]La búsqueda de reguladores positivos de angiogénesis ha dado lugar a muchos candidatos entre los que se incluyen, el aFGF, el bFGF, el TGF-α, el TGF-β, el HGF, el TNF-α, la angiogenina, la IL-8, etc. (Folkman y col. y Kagsbrun y col.). Entre los reguladores negativos identificados hasta el momento se incluyen la trombospondina (Good y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6624-6628 (1990)), el fragmento N-terminal de 16 kilodaltons de la prolactina (Clapp y col., Endocrinology, 133: 12921299 (1993)), la angiostatina (O'Reilly y col., Cell, 79:315-328 (1994)) y la endostatina (O'Reilly y col., Cell, 88:277-285 (1996)). [0004] El trabajo realizado en los últimos años ha establecido el papel clave del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF)en la regulación de la angiogénesis normal y anormal (Ferrara y col., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)). El descubrimiento de que la pérdida de incluso un solo alelo de VEGF conlleva la letalidad del embrión indica que este factor jugaría un papel irreemplazable en el desarrollo y diferenciación del sistema vascular (Ferrara y col.). Además, se ha demostrado que el VEGF es un mediador clave en la neovascularización asociada a tumores y a trastornos intraoculares (Ferrara y col.). El mRNA del VEGF se sobreexpresa en la mayoría de los tumores humanos examinados (Berkman y col., J Clin Invest 91:153-159 (1993); Brown y col., Human Pathol., 26:86-91 (1995); Brown y col., Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern y col., Brit. J.Cancer. 73:931-934 (1996); y Dvorak y col., Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)). También está fuertemente correlacionada la concentración de VEGF en los fluidos oculares con la presencia de proliferación vascular activa de vasos sanguíneos en pacientes con retinopatía diabética y con otras retinopatías relacionadas con isquemia. (Aiello y col. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)). Además, estudios recientes han demostrado la localización de VEGF en las membranas neovasculares coroidales en pacientes afectados por AMD (Lopez y col., Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)). Los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF suprimen el crecimiento de una variedad de líneas celulares tumorales humanas en animales nude (Kim y col., Nature 362:841-844 (1993); Warren y col., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgström y col., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); y Melnyk y col. Cancer Res. 56:921-924 (1996)) y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos isquémicos de retina (Adamis y col., Arch. Ophthalmol. 114:66-71(1996)). Por tanto, los anticuerpos monoclonales anti-VEGF u otros inhibidores de la acción del VEGF son candidatos prometedores para el tratamiento de tumores sólidos y de varios trastornos neovasculares intraoculares. [0005] Baca y col., (1997) J. Biol. Chem. 272(16), 10678-10684 describen la humanización de un anticuerpo anti-VEGF murino A4.6.1 mediante expresión en fagos. DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN [0006] Esta solicitud describe anticuerpos anti-VEGF humanizados y variantes de anticuerpos anti-VEGF que presentan propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica, incluyendo una fuerte afinidad de unión por el VEGF; la capacidad de inhibir la proliferación de células endoteliales in vitro inducida por el VEGF; y la capacidad de inhibir la angiogénesis inducida in vivo por el VEGF. [0007] La presente invención proporciona dichos anticuerpos para su uso en un ensayo de diagnóstico in vivo y el uso de dichos anticuerpos en la fabricación de un reactivo para su uso en un ensayo de diagnóstico in vivo, tal como se define en las reivindicaciones.

El anticuerpo anti-VEGF preferido o la variante del anticuerpo anti-VEGF preferidos, aquí descrito, se une al VEGF humano con un valor de Kd no superior a aproximadamente 1 x 10-8M y preferentemente no superior a aproximadamente 5 x 10-9M. Además, el anticuerpo anti-VEGF humanizado o la variante de un anticuerpo anti-VEGF puede tener un valor de ED50 no superior a aproximadamente 5 nM para la inhibición de la proliferación de células endoteliales in vitro inducida por VEGF. Los anticuerpos anti-VEGF humanizados o variantes de los anticuerpos anti-VEGF particularmente interesantes aquí son aquellos que inhiben al menos aproximadamente un 50% del crecimiento tumoral en un modelo de tumor in vivo A673, en la dosis de anticuerpo de 5 mg/kg. [0009] En una realización, el anticuerpo anti-VEGF tiene un dominio variable de cadena pesada y cadena ligera, donde el dominio variable de cadena pesada comprende regiones hipervariables con las siguientes secuencias de aminoácidos: CDRH1 (GYX1FTX2YGMN, donde X1 es T o D y X2 es N o H; SEC ID NO:128), CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR; SEC ID NO:2) y CDRH3 (YPX1YYGX2SHWYFDV, donde X1 es Y o H y X2 es S o T; SEC ID NO:129). Por ejemplo, el dominio variable de cadena pesada puede comprender las secuencias de aminoácidos de CDRH1 (GYTFTNYGMN; SEC ID NO:1), CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR; SEC ID NO:2) y CDRH3 (YPHYYGSSHWYFDV; SEC ID NO:3). Preferentemente, las tres regiones hipervariables de cadena pesada se disponen en una región armazón (“framework”) humana, por ejemplo, como una secuencia contigua representada por la siguiente fórmula: FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4. [0010] Un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-VEGF preferido comprende la secuencia de aminoácidos: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX1FTX2YGMNWVRQAPGKGLEWVG WINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX3 YYG X4SHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEC ID NO:125), donde X1 es T o D; X2 es N o H; X3 es Y o H y X4 es S o T. Una secuencia de dominio variable de cadena pesada particularmente útil es la del anticuerpo humanizado F(ab)-12 del Ejemplo I y comprende la secuencia del dominio variable de cadena pesada de SEC ID NO:7. Dichas secuencias de dominio variable de cadena pesada preferidas se pueden combinar con las siguientes secuencias de dominio variable de cadena ligera preferidas

o con otras secuencias de dominio variable de cadena, siempre que el anticuerpo producido de esta manera se una al VEGF humano y cumpla los requisitos de las reivindicaciones.

Las secuencias de dominio variable de cadena ligera preferidas se pueden combinar con las secuencias de dominio variable de cadena pesada identificadas anteriormente o con otras secuencias de dominio variable de cadena pesada, siempre que el anticuerpo producido de esta manera mantenga la capacidad de unirse a VEGF humano y cumpla los requisitos de las reivindicaciones. Por ejemplo, el dominio variable de cadena ligera puede comprender regiones hipervariables con las siguientes secuencias de aminoácidos: CDRL1 (SASQDISNYLN; SEC ID NO:4), CDRL2 (FTSSLHS; SEC ID NO:5) y CDRL3 (QQYSTVPWT; SEC ID NO:6). Preferentemente, las tres regiones hipervariables de cadena ligera se disponen en una región armazón humana, por ejemplo, como una secuencia contigua representada por la siguiente fórmula: FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4. [0012] En una realización, la presente invención incorpora un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo anti-VEGF humanizado que comprende la secuencia de aminoácidos: DIQX1TQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSL HSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEC ID NO:124), donde X1 es M o L. Una secuencia de dominio variable de cadena ligera particularmente útil es la del anticuerpo...

1. Anticuerpo anti-factor de crecimiento endotelial vascular humanizado para su uso en un ensayo de diagnóstico in vivo, en donde el anticuerpo inhibe la angiogénesis in vivo inducida por VEGF y/o se une al VEGF humano con un valor de Kd no superior a 1 x 10-8M y/o tiene un valor ED50 no superior a 5 nM para inhibir la proliferación de células endoteliales in vitro inducida por VEGF, teniendo el anticuerpo un dominio variable de cadena pesada que comprende las regiones armazón consenso del subgrupo III de cadena pesada humana tal como se muestra en la SEC ID No. 11 y las regiones hipervariables CDRH1, CDRH2 y CDRH3, que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDRH1: GYX1X2X3X4YGX5N (SEC ID NO: 117), donde X1 es D, T o E, X2 es F, W o Y, X3 es T, Q, G o S, X4 es H o N y X5 es M o I; CDRH2: WINTX1TGEPTYAADFKR (SEC ID NO: 118), donde X1 es Y

o W; y CDRH3 : YPX1YX2X3X4X5HWYFDV (SEC ID NO: 119), donde X1 es H

o Y, X2 es Y, R, K, I, T, E o W, X3 es G, N, A, D, Q, E, T, K o S, X4 es S, T, K, Q, N, R, A, E o G y X5 es S o G; y que tiene un dominio variable de cadena ligera que comprende las regiones armazón consenso del subgrupo I de cadena ligera kappa humana tal como se muestra en la SEC ID No. 12 y las regiones hipervariables CDRL1, CDRL2 y CDRL3, que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

CDRL1: X1AX2X3X4X5SNYLN (SEC ID NO: 121), donde X1 es R o S, X2 es S o N, X3 es Q o E, X4 es Q o D y X5 es I o L;

CDRL2: FTSSLHS (SEC ID NO: 122);

CDRL3: QQYSX1X2PWT (SEC ID NO: 123), donde X1 es T, A o N y X2

es V o T, donde en comparación con la SEC ID NO: 11, el dominio variable de cadena pesada presenta una sustitución en cualquiera de uno o más de los siguientes residuos de las regiones armazón consenso: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H y 94H, y donde en comparación con la SEC ID NO: 12, el dominio variable de cadena ligera presenta una sustitución en, y únicamente en, el residuo 46L de las regiones armazón consenso o presenta sustituciones en los residuos 4L y 46L de las regiones armazón consenso, donde la numeración de los residuos es tal como se muestra en la figura 1.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, donde el dominio variable de cadena ligera presenta una sustitución en, y únicamente en, el residuo 46L de las regiones armazón consenso.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que tiene sustituciones en al menos dos de dichos residuos de cadena pesada.

4. Anticuerpo según la reivindicación 3, que tiene sustituciones en al menos tres de dichos residuos de cadena pesada.

5. Anticuerpo según la reivindicación 4, que tiene sustituciones en al menos cuatro de dichos residuos de cadena pesada.

6. Anticuerpo según la reivindicación 5, que tiene sustituciones en los residuos 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H y 94H.

7. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde: en CDRH1, X1 es D o T, X2 es F, X3 es T y X5 es M; en CDRH2, X1 es Y; y en CDRH3, X2 es Y, X3 es G, X4 es S o T y X5 es S.

8. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde en CDRL1, X1 es S, X2 es S, X3 es Q, X4 es D y X5 es I; y en CDRL3, X1 es T y X2 es V.

9. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos:

"CDR7": X1SX2DX3X4X5X6TX7 (SEC ID NO: 120), donde X1 es F, I, V, L o A, X2 es A, L, V o I, X3 es T, V o K, X4 es S o W, X5 es S o K, X6 es N o S y X7 es V, A, L o I.

10. Anticuerpo según la reivindicación 9, donde en CDR7, X1 es F, X2 es L, X3 es T, X4 es S, X5 es K, X6 es S y X7 es A.

11. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de SEC ID NO: 7 y/o la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de SEC ID NO: 8.

12. Anticuerpo según la reivindicación 11, que tiene la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de SEC ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de SEC ID NO: 8.

13. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano con un valor de Kd no superior a aproximadamente 1 x 10-8 M.

14. Anticuerpo según la reivindicación 13, que se une al VEGF humano

con un valor de Kd no superior a aproximadamente 5 x 10-9 M.

15. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo completo.

16. Anticuerpo según la reivindicación 15, que es una IgG humana.

17. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que es un fragmento de anticuerpo.

18. Anticuerpo según la reivindicación 17, que es un Fab.

19. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el ensayo de diagnóstico es para el cáncer.

20. Anticuerpo según la reivindicación 19, que está marcado con un radionucleido.

21. Anticuerpo según la reivindicación 20, donde el ensayo comprende la localización del tumor mediante inmunoescintografía.

22. Utilización de un anticuerpo tal como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en la fabricación de un reactivo para su uso en un ensayo de diagnóstico in vivo para el cáncer.

23. Utilización según la reivindicación 22, donde el anticuerpo está marcado con un radionucleido. 24. Utilización según la reivindicación 23, donde el ensayo comprende la localización del tumor mediante inmunoescintografía. 25. Utilización de un anticuerpo tal como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en un ensayo de diagnóstico in vitro para la proteína VEGF. 26. Utilización según la reivindicación 25, donde el ensayo de diagnóstico es para el cáncer. 27. Utilización según la reivindicación 25 o la reivindicación 26, donde el anticuerpo está marcado con un grupo detectable. 28. Utilización según la reivindicación 27, donde el marcador es un radioisótopo, un marcador fluorescente o un marcador enzima-sustrato. 29. Utilización según la reivindicación 27 o la reivindicación 28, donde el marcador está conjugado indirectamente con el anticuerpo.