Anticuerpos anti-TSHR humanos.

Una molécula de anticuerpo aislada que se une al TSHR para estimular al TSHR,

comprendiendo la molécula de anticuerpo un dominio VL de anticuerpo que comprende SEC ID Nº:24 para CDR I, SEC ID Nº:25 para CDR II y SEC ID Nº:26 para CDR III y un dominio VH de anticuerpo que comprende SEC ID Nº:6 para CDR I, SEC ID Nº:7 para CDR II y SEC ID Nº:8 para CDR III.

Anticuerpos anti-TSHR humanos Campo de la invención

La presente invención se refiere a un autoanticuerpo monoclonal humano (MAb) reactivo con el receptor de la hormona estimulante de tiroides (TSH) (TSHR). El MAb humano (K1-18) tiene la capacidad de unirse al TSHR y de estimular la actividad de AMP cíclico de TSHR. El MAb humano se aisló de los linfocitos periféricos de un paciente que presentaba síntomas clínicos de hipotiroidismo.

Antecedentes

La función tiroidea está regulada por TSH secretada por la hipófisis (Szkudlinski MW, et al 2002. Physiological Reviews 82: 473-502). La TSH se une con TSHR en la superficie de tirocitos y esto es la primera etapa en el inicio de la cascada de señalización de TSHR. La unión de TSH con el TSHR da lugar a la estimulación de la formación o liberación de hormonas tiroideas; tirosina (T4) y tri-yodotironina (T3). Un mecanismo de retroalimentación que implica los niveles de T4 y T3 en la circulación y hormona liberadora de tirotropina (TRH) secretada por el hipotálamo controla la liberación de TSH que a su vez controla la estimulación de la tiroides y los niveles de hormonas tiroideas en suero (Szkudlinski MW, et al, 2002, mencionado anteriormente). El TSHR es un receptor acoplado a proteína G y está compuesto de tres dominios: un dominio de repetición rico en leucina (LRD), un dominio de escisión (CD) y un dominio transmembrana (TMD) (Núñez Miguel R, et al 2004. Thyroid 14: 991-1011)-

Está bien documentado en la técnica que algunos pacientes con enfermedad tiroidea autoinmunitaria (AITD) desarrollan autoanticuerpos que son reactivos con el TSHR (Rees Smith B, et al 1988. Endocrine Reviews 9: 106- 121). Hay dos tipos principales de autoanticuerpos de TSHR (TRAb); un tipo estimulante y un tipo de bloqueo. Los autoanticuerpos de tipo estimulante de la tiroides se unen con el TSHR e imitan las acciones de la TSH estimulando de este modo la tiroides para que produzca altos niveles de T4 y T3; estos autoanticuerpos también se describen como TRAb con actividad estimulante o actividad agonista de TSH (Rees Smith B, et al 2007. Thyroid 17: 923-938). El mecanismo de control de retroalimentación de la función tiroidea ya no es eficaz en presencia de autoanticuerpos estimulantes de la tiroides y pacientes que presentan los síntomas clínicos de una tiroides hiperactiva caracterizado por un exceso de hormonas tiroideas en suero y sus consecuencias metabólicas. Esta afección se conoce como enfermedad de Graves. Los TRAb con actividad estimulante también pueden interaccionar con los TSHR en tejido - orbital y contribuir al desarrollo de las señales oculares de enfermedad de Graves. Se ha descrito en detalle en el documento WO 2004/050708A2 un autoanticuerpo monoclonal humano que actúa como un estimulador potente de la tiroides (hMAb TSHR1; también denominado M22). La estructura del complejo de M22 Fab unido con el TSHR LRD se ha resuelto por cristalografía de rayos X a una resolución de 2,55 A como se describe en el documento WO 2008/025991A1. El análisis de la estructura del complejo de TSHR - M22 proporciona información detallada acerca de los restos del receptor y los restos del autoanticuerpo estimulante implicados en las interacciones entre sí.

Se ha usado M22 en ELISA para medición del anticuerpo de TSHR (Zóphel, K et al, Clínica Chimica Acta 2009 y Zóphel, K et al, Clínica Chimica Acta 2008).

Los TRAb de tipo de bloqueo aparecen menos frecuentemente en pacientes con AITD que los autoanticuerpos estimulantes. Los autoanticuerpos de tipo de bloqueo se unen con el TSHR, evitan que TSH se una con el receptor pero no tienen capacidad para estimular la actividad de TSHR. En consecuencia la formación y secreción de hormonas tiroideas (T4 y T3) se reduce en gran medida y los pacientes con este tipo de TRAb pueden presentar síntomas clínicos de un tiroides infraactivo (hipotiroidismo). Los autoanticuerpos de tipo bloqueo se conocen como TRAb con actividad de bloqueo o actividad antagonista de TSH (Rees Smith B, etal 1988 mencionado anteriormente y Rees Smith B, 2007 et al mencionado anteriormente). Los TRAb con actividad de bloqueo cuando están presentes en suero de mujeres embarazadas cruzan la placenta y pueden bloquear los TSHR en la tiroides fetal conduciendo a hipotiroidismo neonatal y graves consecuencias para el desarrollo. Además, los TRAb con actividad de bloqueo pueden encontrarse en leche materna de madres afectadas y pueden provocar hipotiroidismo clínico en el bebé (Evans C, et al 2004 European Journal of Endocrinology 150: 265-268). Un autoanticuerpos humano para el TSHR con actividad antagonista de TSHR (5C9) se ha descrito en detalle en el documento WO 2008/099185A1. Los síntomas clínicos en pacientes con AITD y TRAb en circulación están relacionados con el efecto de autoanticuerpos en la actividad de TSHR, es decir si los TRAb provocan estimulación o bloqueo. Se ha propuesto, sin embargo, que en algunos pacientes puede estar presente simultáneamente una mezcla de TRAb de estimulación y bloqueo con la presentación clínica general relacionada con mayor concentración y/o actividad de un tipo de los TRAbs (Rees Smith B et al 1988 mencionado anteriormente; Furmaniak et ah 993 Springer Seminars in Immunopathology 14: 309-321 y Schott M et al 2005 Trends in Endocrinology and Metabolism 16: 243-248). Además, las concentraciones y/o actividades de TRAb estimulantes o de bloqueo pueden variar en el mismo paciente durante la evolución de la enfermedad y de hecho se ha presentado fluctuación de síntomas de hipo a hipertiroidismo en el mismo paciente a lo largo del tiempo (Rees Smith B et al 1988 mencionado anteriormente; Furmaniak J y Rees Smith B 1993 mencionado anteriormente y Schott M et al 2005 mencionado anteriormente). Sin embargo, los intentos de separar los TRAb con diferente bioactividad o de diferenciar entre estos TRAb en muestras de suero usando bioensayos

disponibles en la actualidad son difíciles. Más recientemente, la invención descrita en el documento WÓ2006/016121A1 proporciona un medio para diferenciar entre tipos de TRAb estimulantes y de bloqueo usando bioensayos que emplean TSHR mutado en R255.

La TSH recombinante humana (Thyrogen®) es una preparación de TSH humana producida según las regulaciones de GMPc como una proteína recombinante y aprobada por la FDA de Estados Unidos como una ayuda para el diagnóstico de cáncer tiroideo residual o recurrente (Duntas LH, Cooper DS 2008 Thyroid 18: 509-516). El control de los pacientes con cáncer tiroideo después del tratamiento incluye la estimulación de restos de tiroides o metástasis con TSH humana recombinante seguido de una exploración de tiroides y/o medida de los niveles de tiroglobulina en suero (Duntas LH y Cooper DS 2008 mencionado anteriormente). La gonadotropina coriónica humana es una hormona producida durante el embarazo que tiene efectos leves estimulantes de la tiroides (Grossmann M et al 1997 Endocrine Reviews 18: 476-501). La caracterización de los tipos de TRAb estimulantes o de bloqueo y cómo interaccionan con el TSHR tiene importancia clínica para el desarrollo de métodos mejorados para diagnosticar y controlar diferentes formas de AITD. Además estos estudios son críticos para desarrollar nuevas estrategias para el control de enfermedades asociadas con una respuesta autoinmunitaria al TSHR. La disponibilidad de estimuladores de la tiroides potentes diferentes de TSH humana recombinante proporcionan nuevas alternativas para controlar y tratar a pacientes con cáncer de tiroides.

Solicitudes de Patente previas relacionadas

La invención descrita en el documento W02004/050708A2 proporciona detalles de las propiedades de un autoanticuerpo monoclonal humano (MAb) con actividad estimulante potente y su interacción con el TSHR. Las interacciones entre este otro autoanticuerpo (M22) y el TSHR LRD se han resuelto a nivel molecular a partir de un análisis de difracción de rayos X (resolución de 2,55 Á) de un complejo entre las dos moléculas como se describe en el documento W02008/025991 A. El documento W02006/016121A1 desvela una preparación del TSHR mutado que incluye al menos una mutación puntual que puede usarse en la exploración diferencial e identificación de autoanticuerpos de TSHR estimulantes en suero del paciente, autoanticuerpos de TSHR de bloqueo en suero del paciente y TSH en una muestra de fluido corporal de un paciente que se está explorando. También se describe en el documento W02004/050708A2 la generación y caracterización de un MAb de ratón (9D33) con actividad de bloqueos de TSRH. 9D33 se une con el TSHR con alta afinidad (2 x 1010 l/mol) y es un antagonista eficaz de TSH, hMAb TSHR1 (M22) y TRAb en suero de paciente con actividades estimulantes o de bloqueo. El documento W02008/099185A1 desvela el aislamiento y caracterización... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de anticuerpo aislada que se une al TSHR para estimular al TSHR, comprendiendo la molécula de anticuerpo un dominio VL de anticuerpo que comprende SEC ID N2:24 para CDR I, SEC ID N2:25 para CDR II y SEC ID N2:26 para CDR III y un dominio VH de anticuerpo que comprende SEC ID N2:6 para CDR I, SEC ID N2:7 para CDR II y SEC ID N2:8 para CDR III.

2. Una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende un dominio VL de anticuerpo seleccionado de las secuencias de aminoácidos de SEC ID N2 23 y SEC ID N2 33 y/o un dominio de VH de anticuerpo seleccionado de las secuencias de aminoácidos de SEC ID N2 5 y SEC ID N215.

3. Un nucleótido aislado que codifica una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2.

4. Un vector que incluye un nucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Una célula hospedadora que incluye un nucleótido de acuerdo con la reivindicación 3 o un vector de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2.

7. Una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en terapia.

8. Un método para caracterizar la actividad de los anticuerpos de TSHR, TSH o gonadotropina coriónica humana, comprendiendo el método una etapa que incluye el uso de una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2.

9. Un método in vitro para estimular el TSHR en células de mamífero, comprendiendo el método poner en contacto las células con una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6.

10. Una molécula de anticuerpo aislada de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento de cáncer de tiroides, bocio multinodular de tiroides o hipotiroidismo congénito.

11. Un método diagnóstico para detectar autoanticuerpos de analitos para el TSHR, comprendiendo el método poner en contacto una muestra, que se ha aislado de un sujeto del que se cree que contiene dichos autoanticuerpos de analitos, y una molécula de anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 con un TSHR o un fragmento del mismo.