Anticuerpos anti-NIK y sus usos.

Una preparación que comprende anticuerpos policlonales y/o fragmentos F(ab')2 de los mismos,

en dondelos anticuerpos se dirigen contra un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

Anticuerpos anti-NIK y sus usos.

Campo de la invención La presente invención se refiere a moléculas inmunorreguladoras. Más particularmente, la presente invención se refiere a anticuerpos o a fragmentos de anticuerpos, tal y como se definen en las reivindicaciones, capaces de unirse específicamente a la cinasa inductora de NF-KB (NIK) /MAP3K14, o a una porción específica de la misma.

Antecedentes de la invención No existe ningún tratamiento o ninguno que sea satisfactorio para numerosas enfermedades letales y/o sumamente debilitantes, asociadas con una alteración de la regulación de la actividad de moléculas NF-KB, que incluyen enfermedades cancerígenas y enfermedades asociadas con respuestas inmunes patológicas, tales como enfermedades autoinmunes, alérgicas, inflamatorias y relacionadas con trasplantes.

Las moléculas de la familia NF-KB son complejos de factores de transcripción eucariotas, esenciales para la regulación de la respuesta inmune, el crecimiento celular y la supervivencia (Ghosh S y col., 1998. Annu Rev Immunol. 16:225-60) , que se activan de forma inducible por casi todos los miembros de la familia de receptores TNF/NGF. Las moléculas NF-KB son secuestradas generalmente en el compartimento citoplásmico mediante una asociación física con una familia de inhibidores citoplásmicos ricos en anquirina, denominados IKB, que incluyen IKBa y proteínas relacionadas (Baldwin AS. Jr., 1996. Annu Rev Immunol. 14:649-83) . Como respuesta a diversos estímulos, que incluyen citocinas, mitógenos, y ciertos productos génicos víricos, IKB es rápidamente fosforilada en Ser32 y Ser36, y se ubiquitiniza y se degradada posteriormente con el proteasoma 26S. Esto permite que la NF-KB liberada se traslade al núcleo y participe en la transactivación del gen diana (Mercurio F. y Manning A.M., 1999. Curr Opin Cell Biol. 11:226-32; Pahl, H.L., 1999. Oncogene 18:6853-66) . Recientes estudios de clonación molecular han identificado un complejo con múltiples subunidades de cinasa de IKB (IKK) que media en la fosforilación inducida con señal, de IKB, el inhibidor de NF-KB. El complejo IKK está compuesto por dos subunidades catalíticas, IKKa e IKKº, y una subunidad reguladora IKKy (NEMO) . La actividad catalítica de IKKa e IKKº se puede activar por una variedad de diferentes inductores de NF-KB, que incluyen citocinas inflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral (TNF) y la interleucina-1 (IL-1) , el receptor de linfocitos T (TCR) y la proteína coestimuladora de linfocitos T, CD28 (Karin, M. y Ben-Neriah, Y., 2000. Annu Rev Immunol. 18:621-63) .

La cinasa inductora de NF-KB (NIK, del inglés, NF-KB-inducing kinase) ) /MAP3K-14 (Publicación de la OMPI n° WO9737016A1 de los presentes inventores) es decisiva para la activación de NF-KB. Por ejemplo, se ha mostrado que la hiperexpresión de NIK conduce a una activación espectacular de NF-KB (revisado por Wallach D. y col., 2002. Arthritis Res. 4 Supl. 3:p189-96) , y que la expresión de mutantes de NIK catalíticamente inactivos conduce a la inhibición eficaz de la activación de NF-KB como respuesta a una variedad de activadores conocidos de NF-KB, tales como LMP1, receptor de TNF (TNFR) -1, TNFR-2, RANK, receptor Toll humano, CD3/CD28, receptor de IL-1 (IL-1R) , virus linfotrópico de linfocitos B humanos (HTLV) -1, proteína Tax y lipopolisacárido (LPS) (Malinin, N.L. y col., 1997. Nature 385:540-4; Sylla, B.S. y col., 1998. Proc Natl Acad Sci USA 95:10106-11; Darnay, B.G. y col., 1999. J Biol Chem. 274:7724-31; Lin, X. y col., 1999. Immunity 10:271-80; Geleziunas, R. y col., 1998. Mol Cell Biol. 18:5157-65) . La alteración dirigida del gen NIK (Yin, L. y col., 2001. Science 291:2162-5) , y el estudio de la cepa de ratón con “alinfoplasia” (aly) que es portadora de una mutación puntual natural de sentido erróneo Gly855Arg en NIK (Shinkura, R. y col., 1999. Nat Genet. 22:74-7) , reveló que NIK tiene un papel esencial en el desarrollo de los órganos linfoides. Tanto los ratones aly/aly como los que tienen el gen NIK desactivado, manifiestan una ausencia sistémica de los ganglios linfáticos y las placas de Peyer, unas estructuras esplénicas y tímicas desorganizadas, e inmunodeficiencia cuyos rasgos más destacados son niveles bajos de Ig en suero y carencia de rechazo a trasplantes (Shinkura, R. y col., 1999. Nat Genet. 22:74-7) . Estas anomalías reflejan aparentemente una señalización aberrante de una variedad de receptores. Las carencias evolutivas de los ratones mutantes en NIK, se asemejan a aquellas encontradas en ratones carentes del receptor de LT-º (LT-PR) , sugiriendo que NIK también participa en la señalización por este receptor en particular. Se pudo demostrar que el deterioro de la capacidad proliferativa de los linfocitos B en los ratones alylaly se corresponde con una respuesta insuficiente de estas células frente a LPS y el ligando de CD40 (CD40L; Garceau, N. y col., 2000. J. Exp. Med. 191:381-6) , y la presencia de cantidades excesivas de células BI en la cavidad peritoneal de ratones podría atribuirse a defectos en el autoguiado de células peritoneales al sistema tisular linfático asociado al intestino (GALT) como consecuencia de una señalización insuficiente del receptor de quimiocina en el tejido linfoide secundario (Fagarasan, S. y col., 2000. J. Exp. Med. 191:1477-1486) .

Un papel importante y general de NIK en la señalización de los receptores de citocinas ha sido mostrado recientemente en estudios realizados por Wallach y col., utilizando un sistema de dos híbridos, en donde se muestra que la cadena y del receptor de IL-2, o la "cadena y común", que es un componente de la señalización de los receptores de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15 e IL-21, se asocia específicamente con NIK (documento PCT/IL 03/00317) . Se observó que la hiperexpresión de la cadena y común potenciaba la activación de NF-KB mediada por NIK, y que después de la estimulación de IL-2 o IL-15, NIK y los componentes del señalosoma se unían a la cadena y común. Estos resultados indican, por tanto la participación de NIK en la señalización a través de la gran variedad

de receptores de citocinas que componen la cadena y común, como una subunidad de la señalización.

Aparte de estas y otras contribuciones a la regulación del desarrollo y la función del sistema inmunológico, NIK también está implicado en la regulación de diversas funciones no inmunes. Los ratones aly/aly (aunque no los que tienen el gen NIK desactivado) muestran un desarrollo insuficiente de la glándula mamaria (Miyawaki, S. y col., 1994. Eur. J. Immunol. 24:429-34) . Por otra parte, estudios in vitro han implicado a NIK en la señalización que conduce a la diferenciación celular del músculo esquelético (Canicio, J. y col., 2001. J Biol Chem. 276:20228-33) , y a la supervivencia y la diferenciación de las neuronas (Foehr, E.D. y col, 2000. J Biol Chem. 275:34021-4) .

Coincidiendo con el papel sugerido de NIK como mediador de la activación de NF-KB, los fibroblastos obtenidos a partir de ratones aly/aly y ratones con el gen de NIK desactivado, no lograban activar NF-KB como respuesta a la activación de LT-R. Por otra parte, la regulación a la alza con LT-R de VCAM-1, que ocurre a través de la activación de NF-KB, es anormal en fibroblastos embrionarios de ratón aly/aly (MEFs; Matsumoto, M. y col., 1999. J Immunol. 163:1584-1591) . La fosforilación insuficiente de IKB también se ha observado en la respuesta de los linfocitos B aly/aly a la ligación de CD40. En contraste, en las células dendríticas de estos ratones, la fosforilación inducida por CD40 de IKB parecía normal (Garceau, N. y col., 2000. J. Exp. Med. 191:381-6) . Las células peritoneales aly/aly también son incapaces de responder a la quimiocina SLC con un aumento de la actividad de NF-KB (Fagarasan, S. y col., 2000. J. Exp. Med. 191:1477-86) .

La evaluación del patrón de especies de NF-KB expresadas en los órganos linfoides de ratones aly/aly, indicaba que, además de su papel en la regulación de complejo (s) NF-KB, constituido (s) por proteínas Rel (A + p50) e IKB, NIK también participa en el control de la expresión/activación de otras especies de NF-KB. En particular, linfocitos de aly/aly carecen de p52, una especie de NF-KB que se forma específicamente en linfocitos B maduros a través del procesamiento proteolítico de un precursor inactivo, p100 (NF-KB2) , lo que sugiere una carencia en la conversión de p100 a p52 (Yamada, T. y col., 2000. J Immunol. 165:804-12) . En efecto, se ha observado que NIK participa en la fosforilación específica del sitio de p100. Ambas conducen directamente a la fosforilación de IKKa, que a su vez fosforila a p100. Esta fosforilación sirve como un disparador molecular para la ubiquitinación y el procesamiento activo... [Seguir leyendo]

1. Una preparación que comprende anticuerpos policlonales y/o fragmentos F (ab’) 2 de los mismos, en donde los anticuerpos se dirigen contra un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

2. La preparación de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG.

3. La preparación de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es procedente de ratón.

4. La preparación de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, capaz de detectar específicamente la cinasa que induce NF-KB (NIK) mediante

(a) análisis por inmunotransferencia Western;

(b) ELISA; o

(c) inmunoprecipitación.

5. La preparación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que los anticuerpos se preparan inmunizando un mamífero no humano con un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 11.

6. La preparación de acuerdo con la reivindicación 5, capaz de detectar NIK de múrido.

7. La preparación de acuerdo con la reivindicación 5, preparada inmunizando un roedor.

8. Un método para preparar un anticuerpo monoclonal anti-NIK que comprende la inmunización de un mamífero no humano con un péptido, que forma parte de la secuencia de aminoácidos de NIK, y que es SEQ ID NO:

11.

9. El anticuerpo monoclonal anti-NIK producido por el clon del hibridoma Pep 11-355.8, depositado en la CNCM con el número I-3093.

10. Un clon de hibridoma depositado en la CNCM con el número I-3093.

11. Una composición de materia que comprende un sustrato fijado de manera covalente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, capaz de capturar selectivamente un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de unirse específicamente a SEQ ID NO: .

12. La composición de materia de acuerdo con la reivindicación 11, en la que dicho sustrato es una matriz de cromatografía de afinidad.

13. La composición de materia de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en la que dicho sustrato comprende un hidrato de carbono o un derivado de dicho hidrato de carbono.

14. La composición de materia de acuerdo con la reivindicación 13, en la que dicho hidrato de carbono se selecciona entre el grupo consistente en agarosa, sefarosa y celulosa.

15. La composición de materia de acuerdo con la reivindicación 11, en la que dicho sustrato se selecciona entre el grupo que consiste en una perla, una resina o una superficie de plástico.

16. Un método para preparar un anticuerpo monoclonal anti-NIK que comprende hacer crecer el clon de hibridoma Pep 11-355.8, depositado en la CNCM con el número I-3093 en un medio líquido o en el abdomen de un mamífero para permitir que el hibridoma produzca y acumule el anticuerpo monoclonal.

17. Un método in vitro para la purificación de una proteína que se une a NIK, que comprende poner en contacto una muestra que contiene NIK y la proteína que se une a NIK con una preparación de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 9, co-inmunoprecipitar NIK y la proteína que se une a NIK, lavar el complejo inmune producido y recuperar la proteína que se une a NIK desde el complejo inmune empleando un péptido competidor obtenido a partir de NIK.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la muestra se selecciona a partir de fluidos corporales, extractos celulares y genotecas de expresión de ADN.

19. Uso de una preparación de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 9, para el desarrollo de un ensayo ELISA.

20. Uso de una preparación de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de un

anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 9, para la purificación inmune de NIK.