Un anticuerpo monoclonal humano aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:

7 y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:8, donde el fragmento de unión al antígeno se selecciona entre un fragmento Fab, Fab', F(ab')2, facb, Fv o scFv

Anticuerpos anti-integrina dual, composiciones, métodos y usos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos, incluyendo porciones especificadas, específicos para la proteína integrina dual alfa-v-beta3 y alfa-v-beta5, así como los ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos anti-integrina dual, los vectores, las células anfitrionas, y los métodos de elaboración y sus usos, incluidas las formulaciones y dispositivos terapéuticos.

Técnica relacionada

En la actualidad existen pruebas considerables de que el crecimiento tumoral progresivo depende de la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos, para proporcionar a los tumores nutrientes y oxígeno, para eliminar productos de desecho y para actuar como conductos de la metástasis de las células tumorales a sitios distantes (Gastl et al. Onco1. 54:177-184). Estudios recientes han definido adicionalmente el papel de las integrinas en el proceso angiogénico. Las integrinas son proteínas transmembrana heterodiméricas que juegan papeles críticos en la adherencia celular a la matriz extracelular (MEC), que, a su vez, media la supervivencia, la proliferación y la migración celular a través de la señalización intracelular. Durante la angiogénesis, varias integrinas que se expresan en la superficie de las células endoteliales activadas regulan interacciones de adherencia críticas con una variedad de proteínas de MEC para regular distintos eventos biológicos tales como la migración, la proliferación y la diferenciación celular. Específicamente, se ha demostrado que las integrinas estrechamente relacionadas pero distintas aVb3 y aVb5 median rutas independientes en el proceso angiogénico. Un anticuerpo generado contra aVß3 bloqueó la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), mientras que un anticuerpo específico contra aVß5 inhibió la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) (Eliceiri, et al., J. Clin. Invest.103: 1227-1230 (1999); Friedlander et al., Science 270: 1500-1502 (1995)).

Los anticuerpos policlonales (por ejemplo, anti-sueros) y/o monoclonales, quiméricos, de mamíferos no humanos, (Acm) y sus fragmentos (por ejemplo, sus productos de digestión proteolítica o proteínas de fusión) son agentes terapéuticos potenciales que están siendo investigados en algunos casos para intentar el tratamiento de ciertas enfermedades. Sin embargo, tales anticuerpos o fragmentos pueden provocar una respuesta inmunitaria cuando se administran a seres humanos. Tal respuesta inmunitaria puede dar lugar a un aclaramiento mediado por el complejo inmunitario de los anticuerpos o fragmentos de la circulación, y hacer la administración repetida no apta para la terapia, reduciendo así el beneficio terapéutico para el paciente y limitando la readministración del anticuerpo o fragmento. Por ejemplo, la administración repetida de anticuerpos o fragmentos que comprenden porciones no humanas puede conducir a enfermedad del suero y/o anafilaxis. Con el fin de evitar estos y otros problemas, se han adoptado una serie de enfoques para reducir la inmunogenicidad de estos anticuerpos y sus porciones, incluyendo la quimerización y la humanización, también conocidas en la técnica. Estos y otros enfoques, sin embargo, todavía pueden dar lugar a anticuerpos o fragmentos con alguna inmunogenicidad, baja afinidad, baja avidez, o con problemas en el cultivo celular, el aumento a escala, la producción y/o los bajos rendimientos. Por lo tanto, tales anticuerpos o fragmentos puede ser menores que los adecuados idealmente para la fabricación o utilización como proteínas terapéuticas.

En consecuencia, existe la necesidad de proporcionar anticuerpos o fragmentos anti-integrina dual que superen uno más de estos problemas, así como las mejoras sobre los anticuerpos conocidos o sus fragmentos.

El documento WO 00/31248 describe anticuerpos diseñados mediante ingeniería genética o monoclonales recombinantes humanizados y otros, para receptores de integrina heterodiméricos que contienen la subunidad Alfa V humana. Se supone que tales anticuerpos son útiles para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de enfermedades mediadas por estos receptores, tales como el cáncer.

Lehmann et al. (1994) Cancer Res. 54(8): 2102-7 describe un anticuerpo monoclonal denominado 69-6-5 originado contra células HT29 de carcinoma de colon humano viables completas. Se supone que el anticuerpo reacciona con varias integrinas Alfa V e interfiere eficazmente en las funciones de adherencia de al menos Alfa V Beta 5 y Alfa V Beta 6.

Mitjans et al. (1995) J Cell Sci. 108(Pt 8): 2825-38 describe una serie de anticuerpos monoclonales de múrido originados contra la integrina Alfa V Beta 3 humana purificada y células de melanoma humano M21. Se supone que un anticuerpo, 17E6, perturba la unión celular mediada por integrinas Alfa V, e inhibe la unión celular a ligandos Alfa V de vitronectina y fibronectina.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos anti-integrina dual humanos aislados y sus porciones especificadas, así como composiciones de anticuerpo anti-integrina dual, ácidos nucleicos que los codifican, vectores, células anfitrionas, composiciones, formulaciones, dispositivos, animales transgénicos no humanos, plantas transgénicas, y métodos de elaboración y sus usos, tal como se describe y se posibilita en la presente memoria, combinado con lo que se conoce en la técnica.

En particular, la presente invención proporciona el anticuerpo o su fragmento de las reivindicaciones 1-10.

La presente invención también proporciona la composición de las reivindicaciones 11-12, el ácido nucleico de las reivindicaciones 13-15, la célula anfitriona de las reivindicaciones 16-17, el método de la reivindicación 18, el animal de la reivindicación 19; el uso de las reivindicaciones 20-27 y 14-25, el medicamento de la reivindicación 23, el artículo de las reivindicaciones 26-27, el dispositivo de la reivindicación 28, el animal o vegetal de la reivindicación de 29 y el método de la reivindicación 30.

La secuencia de aminoácidos del anticuerpo puede comprender opcionalmente al menos una sustitución inserción o deleción especificadas tal como se describe en la presente memoria o como se conoce en la técnica.

La presente memoria también describe al menos un anticuerpo anti-integrina dual aislado como se describe a continuación, donde el anticuerpo tiene al menos una actividad, tal como, pero no limitada a la inhibición de la unión a vitronectina, la inhibición de la unión de alfa-v beta-3 a al menos uno de un ligando o receptor de alfa-v beta-3, la inhibición de la unión de alfa-v-beta-5 a al menos uno de un ligando o receptor de alfa-v beta-5, la modulación de la angiogénesis, la unión a células que expresan una integrina dual o una integrina sencilla. De ese modo se puede escrutar un anticuerpo anti-integrina dual en busca de la actividad correspondiente de acuerdo con los métodos conocidos, tales como, pero no limitados a; al menos una actividad biológica hacia una proteína integrina dual.

La presente memoria describe en un aspecto, moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden, un polinucleótido de codifica al menos un anticuerpo anti-idiotipo de integrina dual complementario o hibridante, que comprende al menos una secuencia especificada, dominio, porción o variante de la misma. La especificación descrita adicionalmente proporciona vectores recombinantes que comprenden dicho anticuerpo anti-idiotipo de integrina dual que codifica las moléculas de ácido nucleico, las células anfitrionas que contienen tales ácidos nucleicos y/o los vectores recombinantes, así como los métodos de fabricación y/o uso de tales ácidos nucleicos del anticuerpo anti-idiotipo, vectores y/o células anfitrionas.

La presente memoria describe al menos un método para expresar al menos un anticuerpo anti-integrina dual o un anticuerpo anti-idiotipo de integrina dual, en una célula anfitriona, que comprende cultivar una célula anfitriona, como se ha descrito en la presente memoria en condiciones en las que al menos un anticuerpo anti-integrina dual se expresa en condiciones detectables y/o recuperables.

La presente invención también proporciona al menos una composición que comprende (a) un anticuerpo aislado como se describe en la presente memoria, y (b) un portador o diluyente adecuados. El portador o diluyente opcionalmente pueden ser farmacéuticamente aceptables, de acuerdo con los portadores o diluyentes...

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:7 y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:8, donde el fragmento de unión al antígeno se selecciona entre un fragmento Fab, Fab', F(ab')₂, facb, Fv o scFv.

2. Un anticuerpo monoclonal humano aislado de acuerdo con la reivindicación 1.

3. El anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que se une a las integrinas Alfa V Beta 3 y Alfa V Beta 5 humanas con una KD de 10^-7 M o menor.

4. El anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que se une a las integrinas Alfa V Beta 3 y Alfa V Beta 5 humanas con una KD o 10^-8 M o menor.

5. El anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que se une a las integrinas alfa V Beta 3 y Alfa V Beta 5 humanas con una KD de 10^-9 M o menor.

6. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores producido por un hibridoma, donde el hibridoma se prepara a partir de una célula B obtenida de un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen o un transcromosoma de la cadena pesada humana y un transgén o un transcromosoma de la cadena ligera humana, fusionados a una célula inmortalizada.

7. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho anticuerpo neutraliza esencialmente al menos una actividad de las proteínas integrina Alfa V Beta 3 y Alfa V Beta 5 humanas o sus fragmentos.

8. El anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que inhibe completamente la adherencia de las células M21 a la vitronectina.

9. El anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una cadena pesada de IgG1 y una cadena ligera de IgG1.

10. El anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de cualquier reivindicación anterior para su uso en terapia.

11. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal humano aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador farmacéuticamente aceptable.

12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende adicionalmente una cantidad eficaz de al menos uno de una marca detectable o informador, un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un medicamento anti-inflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriásico, un corticoesteroide, un esteroide anabólico, eritropoyetina, un agente inmunizador, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un medicamento de sustitución hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citoquina, un antagonista de citoquina, un radiofármaco, un modulador de receptores de estrógeno, una citotoxina, un agente anticanceroso, un agente alquilante, un antimetabolito o un inhibidor mitótico.

13. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo monoclonal humano o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

14. Un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 13 que codifica el anticuerpo monoclonal humano que comprende el SEQ ID NO:7 y el SEQ ID NO:8.

15. La molécula de ácido nucleico aislado de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, donde la molécula de ácido nucleico se incorpora a un vector de expresión.

16. Una célula anfitriona que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 15.

17. Una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicha célula anfitriona es una célula COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, de mieloma, de linfoma o una célula vegetal.

18. Un método para producir un anticuerpo monoclonal humano o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 16 o la reivindicación 17 en condiciones tales que se exprese el anticuerpo.

19. Un animal transgénico no humano o una planta que expresa el anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

20. Un animal transgénico no humano de acuerdo con la reivindicación 19, donde el animal tiene un genoma que comprende un transgén o transcromosoma de la cadena pesada humana y un transgén o transcromosoma de la cadena ligera humana.

21. El uso de un anticuerpo aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA), LLA de células B, células T o FAB, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mielocítica crónica (LMC), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas, síndrome mielodisplásico (SMD), linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma maligno, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma de páncreas, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de malignidad, tumores sólidos, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastásica, resorción ósea relacionada con el cáncer, dolor óseo relacionado con el cáncer, o enfermedad maligna.

22. El uso de la reivindicación 21, donde el medicamento se administra con una cantidad eficaz de al menos uno de: una marca detectable o informador, un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un medicamento anti-inflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriásico, un corticoesteroide, un esteroide anabólico, eritropoyetina, un agente inmunizador, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un medicamento de sustitución hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citoquina o un antagonista de citoquina.

23. El uso de la reivindicación 21 o la reivindicación 22, donde dicho medicamento es adecuado para la administración parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocardiaca, intraosteal, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdérmica.

24. Un medicamento combinado que comprende el anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y una cantidad eficaz de al menos uno de: una marca detectable o informador, un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un medicamento anti-inflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriásico, un corticoesteroide, un esteroide anabólico, eritropoyetina, un agente inmunizador, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un medicamento de sustitución hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citoquina o un antagonista de citoquina, para el uso simultáneo, separado o secuencial para el tratamiento o la prevención de: una leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA), LLA de células B, células T o FAB, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mielocítica crónica (LMC), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas, síndrome mielodisplásico (SMD), linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma maligno, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma de páncreas, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de malignidad, tumores sólidos, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastásica, resorción ósea relacionada con el cáncer, dolor óseo relacionado con el cáncer, o enfermedad maligna.

25. El uso de una cantidad eficaz de al menos uno de: una marca detectable o informador, un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un medicamento anti-inflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriásico, un corticoesteroide, un esteroide anabólico, eritropoyetina, un agente inmunizador, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un medicamento de sustitución hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citoquina o un antagonista de citoquina, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de: una leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA), LLA de células B, células T o FAB, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mielocítica crónica (LMC), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas, síndrome mielodisplásico (SMD), linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma maligno, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma de páncreas, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de malignidad, tumores sólidos, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastásica, resorción ósea relacionada con el cáncer, dolor óseo relacionado con el cáncer, o enfermedad maligna, donde el paciente ha sido tratado previamente con al menos un anticuerpo o una de sus fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

26. El uso de la reivindicación 21, donde el paciente ha sido tratado previamente con al menos un compuesto o proteína seleccionados entre al menos uno de; una marca detectable o informado, un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un medicamento anti-inflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriásico, un corticoesteroide, un esteroide anabólico, eritropoyetina, un agente inmunizador, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un medicamento de sustitución hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citoquina o un antagonista de citoquina.

27. Un artículo de manufactura, que comprende material de embalaje y un recipiente que comprende una solución o una forma liofilizada de al menos un anticuerpo humano aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

28. El artículo de manufactura de la reivindicación 27, donde dicho recipiente es un componente de un dispositivo o sistema de liberación parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocardiaca, intraosteal, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdérmica.

29. Un dispositivo médico, que comprende al menos un anticuerpo humano aislado o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde dicho dispositivo es adecuado para poner en contacto o administrar dicho al menos un anticuerpo anti-subunidad alfa-V de al menos un modo seleccionado entre parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraosteal, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdérmico.

30. Un método que comprende hacer crecer el animal o planta transgénicos de la reivindicación 19, que produce el anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.