Anticuerpos anti-CD19 con inmunogenicidad reducida.

Anticuerpo anti-CD19 modificado genéticamente que se modifica en comparación con el anticuerpo B4 anti-CD19murino,

para su uso en el tratamiento de enfermedad diseminada de linfoma en combinación con un agentequimioterapéutico seleccionado del grupo que consiste en ciclofosfamida, vincristina y doxorrubicina, en donde dichoanticuerpo anti-CD19 modificado se obtiene por expresión a partir de células YB/0, y la modificación en dichoanticuerpo consiste en la sustitución de la región variable de la cadena pesada murina de SEQ ID NO:13 delanticuerpo parental B4 por SEQ ID NO:17, y la sustitución de la región variable de la cadena liviana murina de SEQID NO:25 del anticuerpo parental B4 por SEQ ID NO:29, y el anticuerpo modificado es menos inmunogénico que elanticuerpo parental B4 anti-CD19 murino no modificado, cuando se administra a un humano pero resulta aún capazde unirse específicamente a CD19 y tomar como diana a células que expresan CD19.

Anticuerpos anti-CD19 con inmunogenicidad reducida Campo de la invención La invención hace referencia en general a regiones variables de cadena liviana y pesada del anticuerpo monoclonal murino B4 anti-CD19 modificadas para reducir su inmunogenicidad, y a su uso para el tratamiento del linfoma en combinación con agentes quimioterapéuticos.

Antecedentes La CD19 es una proteína de superficie que se encuentra en los linfocitos B y en ciertas células cancerígenas derivadas de los linfocitos B, tales como por ejemplo muchos linfomas de linfocitos B. Los anticuerpos monoclonales anti-CD19 han sido generados en ratones y se muestran prometedores en modelos animales pre-clínicos de tipos de cáncer derivados de linfocitos B. Sin embargo, los anticuerpos derivados de ratón generalmente son inmunogénicos en humanos. Se han desarrollado una serie de estrategias para modificar los anticuerpos derivados de ratón para minimizar su inmunogenicidad en humanos. Una estrategia de ese tipo, la quimerización, implica la fusión de las regiones variables de ratón con regiones constantes humanas. Sin embargo, las secuencias de la región variable derivadas de ratón que permanecen tras la quimerización serán a menudo inmunogénicas. Otra estrategia, la humanización, implica la sustitución de las regiones armazón (FR, por sus siglas en inglés) derivadas de ratones dentro de las regiones variables con las secuencias derivadas de humanos más relacionadas, con la reversión opcional de ciertos aminoácidos al aminoácido de ratón correspondiente para mantener la actividad de unión. Sin embargo, incluso los anticuerpos humanizados pueden ser inmunogénicos, dado que las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de anticuerpos generalmente contienen epítopos de linfocitos B y epítopos de linfocitos T que son no propios. De hecho, incluso los anticuerpos completamente humanos son inmunogénicos; ésta es la base de la formación de anticuerpos anti-idiotipo durante el transcurso de una respuesta inmune. Todos estos problemas pueden aplicarse a anticuerpos anti-CD19 derivados de ratón tal como se aplicarían a cualquier otro tipo de anticuerpo. Por lo tanto, existe una necesidad de anticuerpos anti-CD19 con inmunogenicidad reducida.

Resumen de la invención La presente invención está dirigida al uso terapéutico de un anticuerpo B4 monoclonal murino anti-CD19 que ha sido modificado para reducir su inmunogenicidad en comparación con un anticuerpo B4 de tipo salvaje (Wild type) , tal como se define en las reivindicaciones. Más específicamente, la región variable del anticuerpo B4 de la invención se modifica para eliminar epítopos de linfocitos T potenciales. Como resultado, el anticuerpo B4 de la invención presenta propiedades biológicas mejoradas en comparación con los anticuerpos B4 de tipo salvaje.

La región armazón de cadena pesada de la inmunoglobulina no modificada tiene los residuos de aminoácidos tal como se especifica en la SEQ ID NO:13.

La región armazón de cadena liviana de la inmunoglobulina no modificada tiene los residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO:25.

La invención presenta una región variable de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 17 y, SEQ ID NO: 29, en donde la región variable del anticuerpo se une específicamente con CD19.

De manera específica, la invención hace referencia a un método para el tratamiento de un paciente que sufre enfermedades de linfomas, donde el método comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido, de acuerdo con cualquiera de los modos de realización de la invención, a un paciente, en combinación con agentes quimioterapéuticos específicos.

En resunmen, la presente invención hace referencia a un anticuerpo B4 diseñado con ingeniería genética y modificado que comprende la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 17 y la región variable de la cadena liviana de SEQ ID NO: 29 para su uso para el tratamiento de enfermedad de linfoma diseminada en combinación con un agente qumioterapéutico seleccionado del grupo que consiste en ciclofosfamida, vincristina y doxorrubicina, o para su uso para el tratamiento del linfoma de Burkitt en combinación con ciclofosfamida.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo B4 (B4 VH0) (SEQ ID NO:1) .

La figura 2 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena pesada del anticuerpo B4 a modo de ejemplo que incorpora codones para las mutaciones Q5E, R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A, y V93T (B4 VHv4) (SEQ ID NO:5) .

La figura 3 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de la cadena liviana del anticuerpo B4 (B4 VK0) (SEQ ID NO:8) .

La figura 4 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena liviana del anticuerpo B4 a modo de ejemplo que incorpora codones para las mutaciones I10T, M11 L, V19A, S51D, y L53T (B4 VKv4) (SEQ ID NO:12) .

La figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de región variable de la cadena pesada del anticuerpo B4 (B4 VH0) (SEQ ID NO:13) .

La figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada del anticuerpo B4 con las mutaciones Q5E, R19K, L20V, R40T, Q43K, K65D, S85D, S88A, y V93T (B4 VHv4) (SEQ ID NO:17) .

La figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena liviana del anticuerpo B4 (B4 VHK0) (SEQ ID NO:25) .

La figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena liviana del anticuerpo B4 a modo de ejemplo que incorpora las mutaciones I10T, M11L, V19A, S51D, y L53T (B4 VKv4) (SEQ ID NO:29) .

La figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo B4. Las regiones determinantes de complementariedad están subrayadas. Los residuos de aminoácidos modificables se muestran en negrita.

La figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena liviana del anticuerpo B4. Las regiones determinantes de complementariedad están subrayadas. Los residuos de aminoácidos modificables se muestran en negrita.

La figura 11 es un alineamiento de secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada del anticuerpo B4 VH0 (SEQ ID NO:13) , VHv1 (SEQ ID NO:14) , VHv2 (SEQ ID NO:15) , VHv3 (SEQ ID NO:16) , VHv4 (SEQ ID NO:17) , VHv5 (SEQ ID NO: 18) , VHv11 (SEQ ID NO:20) , y VHv34 (SEQ ID NO:21) .

La figura 12 es un alineamiento de secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena liviana del anticuerpo B4 VK0 (SEQ ID NO:25) , VKv1 (SEQ ID NO:26) , VKv2 (SEQ ID NO:27) , VKv3 (SEQ ID NO:28) , VKv4 (SEQ ID NO:29) , VKv11 (SEQ ID NO: 30 y, VKv34 (SEQ ID NO:31) .

La figura 13 muestra los resultados de un ensayo ADCC en células Daudi de linfoma de Burkitt realizado con el anticuerpo B4 VHv4/VKv4 expresado a partir de células HEK 293T (triángulos vacíos) o de células YB2/0 (triángulos rellenos) , y anticuerpo B4 VHv5/Kv4 expresado ya sea a partir de una línea celular NS/0 (círculos vacíos) o de células YB2/0 (círculos rellenos) como se describe en el ejemplo 4.

La figura 14 muestra los resultados del tratamiento de ratones trasplantados con PBMC humanas tratadas con el anticuerpo B4 VHv4/VKv4 de la invención (barras con rayas) , anticuerpo Leu 16 (barras blancas) o PBS (barras negras) como se describe en el ejemplo 5.

La figura 15 muestra los resultados del tratamiento de ratones que portan células de linfoma Namalwa tratadas con el anticuerpo B4 VHv4/VKv4 de la invención (círculos vacíos) o PBS (asteriscos) , tal como se describe en el ejemplo 6.

La figura 16 muestra los resultados del tratamiento de ratones que tienen células de linfoma de Daudi Burkitt tratadas con el anticuerpo B4 VHv4/VKv4 de la invención (triángulos vacíos) , ciclofosfamida (cuadrados vacíos) , una combinación del anticuerpo B4 VHv4/VKv4 y ciclofosfamida (círculos vacíos) o PBS (asteriscos) , tal como se describe en el ejemplo 7.

La figura 17 muestra los resultados del tratamiento de ratones que portan células de linfoma Namalwa con el anticuerpo de la invención combinado con diferentes agentes de quimioterapia, tal como se describe en el ejemplo 8. En la figura 17 (a) los tratamientos son ciclofosfamida (cuadrados vacíos) , el anticuerpo B4 VHv4/VKv4 (X) , una combinación del anticuerpo B4 VHv4/VKv4 y ciclofosfamida (cuadrados rellenos) o PBS (asteriscos) . En la figura 17 (b) los tratamientos son vincristina (triángulos... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo anti-CD19 modificado genéticamente que se modifica en comparación con el anticuerpo B4 anti-CD19 murino, para su uso en el tratamiento de enfermedad diseminada de linfoma en combinación con un agente quimioterapéutico seleccionado del grupo que consiste en ciclofosfamida, vincristina y doxorrubicina, en donde dicho 5 anticuerpo anti-CD19 modificado se obtiene por expresión a partir de células YB/0, y la modificación en dicho anticuerpo consiste en la sustitución de la región variable de la cadena pesada murina de SEQ ID NO:13 del anticuerpo parental B4 por SEQ ID NO:17, y la sustitución de la región variable de la cadena liviana murina de SEQ ID NO:25 del anticuerpo parental B4 por SEQ ID NO:29, y el anticuerpo modificado es menos inmunogénico que el anticuerpo parental B4 anti-CD19 murino no modificado, cuando se administra a un humano pero resulta aún capaz

de unirse específicamente a CD19 y tomar como diana a células que expresan CD19.

2. Anticuerpo anti-CD19 modificado genéticamente que se modifica en comparación con el anticuerpo B4 anti-CD19 murino, para su uso en el tratamiento del linfoma de Burkitt en combinación con el agente quimioterapéutico ciclofosfamida, en donde dicho anticuerpo ant-CD19 se obtiene por expresión a partir de células YB2/0, y la modificación en dicho anticuerpo consiste en la sustitución de la región variable de la cadena pesada murina de la SEQ ID NO:13 del anticuerpo parental B4 por SEQ ID NO:17, y la sustitución de la región variable de la cadena liviana de la SEQ ID NO:25 del anticuerpo parental B4 por SEQ ID NO:29, y el anticuerpo modificado es menos inmunogénico que el anticuerpo parental B4 anti-CD19 murino no modificado cuando se administra a un humano, pero sigue siendo capaz de específicamente unirse a CD19 y tomar como diana a células que expresan CD19.