Anticuerpo que se une a parvovirus H-1.

Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una cápsida de parvovirusH-1 llena o vacía,

uniéndose dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo sólo a una cápsida deparvovirus H-1 nativa pero no a proteínas de la cápsida de parvovirus H-1 desnaturalizadas.

Anticuerpo que se une a parvovirus H-1

La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Por tanto, se refiere a un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una cápsida de parvovirus H-1 llena o vacía, uniéndose dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo sólo a una cápsida de parvovirus H-1 nativa pero no a proteínas de la cápsida de parvovirus H-1 desnaturalizadas. El anticuerpo de la presente invención es útil para diversos métodos diagnósticos y terapéuticos, por ejemplo, para la detección/terapia de una infección por parvovirus H-1.

Parvovirus designa un género de la familia de virus Parvoviridae. El género parvovirus comprende varios virus icosaédricos pequeños que pueden replicarse en ausencia de un virus auxiliar. Parvovirus contiene un ADN monocatenario que tiene una longitud de aproximadamente 5.000 pb. En cada uno de los extremos 3’ y 5’ del ADN 15 hay una secuencia palíndrómica. El ADN codifica para dos proteínas de la cápsida, VP1 y VP2 [figura 1], así como para dos proteínas no estructurales reguladoras, NS-1 y NS-2. Estas últimas proteínas están fosforiladas y muestran localización nuclear o tanto citoplasmática como nuclear, respectivamente. VP3, una tercera proteína de la cápsida, más pequeña, se deriva de VP2 mediante escisión proteolítica. Las dos proteínas de la cápsida VP1 y VP2 están codificadas por marcos de lectura abiertos solapantes de modo que la región que codifica para VP2 está comprendida totalmente dentro de la región que codifica para VP1. En una infección natural, las proteínas de la cápsida se expresan en una razón VP1:VP2 de 1:10 debido a corte y empalme alternativo. Recientemente, se ha mostrado que la región de las proteínas de la cápsida que es específica para VP1 (región N-terminal) contiene motivos comunes a fosfolipasa A celular y de hecho ejerce esta actividad in vitro. La PLA2 secretada, dependiente de calcio con la que VP1 de parvovirus comparte similitudes, toma parte en rutas de señalización que implican lisis celular mediante permeabilización de membranas. Por otro lado, se ha mostrado que NS1 está regulada por miembros de la familia de proteína cinasa C, que a su vez se someten a regulación a través de fosfolipasas.

Los parvovirus habitualmente se toleran bien por las poblaciones de su huésped natural, en el que persisten sin signos patológicos aparentes. Esto se debe tanto a la protección de fetos y recién nacidos por la inmunidad materna, como a la sorprendente restricción de la replicación de parvovirus a un estrecho intervalo de tejidos diana en proliferación en animales adultos. Esta tolerancia del huésped concierne especialmente a parvovirus de roedores, por ejemplo el virus diminuto de ratones (MVM) y el virus H-1 en sus respectivos huéspedes naturales, concretamente ratones y ratas.

Además, los seres humanos pueden infectarse con parvovirus, por ejemplo, parvovirus H-1. De hecho, parvovirus es una infección común, que se presenta habitualmente como eritema infeccioso en niños. Es habitualmente leve y autolimitante en personas sanas. Sin embargo, parvovirus también puede provocar artritis reactiva en adultos, y anemia grave en aquéllos con estados hematológicos o inmunocomprometidos. Además, parvovirus afecta a aproximadamente 1 de cada 400 embarazos y puede provocar pérdida del feto o hidropesía fetal. Por tanto, la identificación de la infección por parvovirus, en particular en una mujer embarazada es importante para la monitorización y el posible tratamiento. Desafortunadamente, los métodos actuales para el diagnóstico/terapia de una infección por parvovirus necesitan mejora, por ejemplo, hasta ahora no está disponible un anticuerpo específico contra parvovirus H-1 ensamblado.

El documento WO 94/10294 A1 se refiere a anticuerpos monoclonales humanos, fragmentos y derivados de los mismos, específicos para parvovirus B19.

Raykov et al., Oncology Reports 17, págs. 1493-1499 (2007) describen actividades de vacunación y oncolíticas combinadas de parvovirus H-1 en un modelo de tumor metastásico.

Maxwell et al., J. of General Virology, 74, págs. 1175-1179 (1993) describen la encapsidación del genoma de parvovirus Lulll recombiannte por virus H1 y las cepas fibrotrópica y linfotrópica de virus diminuto de ratones.

Por tanto, el problema técnico que subyace a la presente invención es proporcionar un medio mejorado para el 55 diagnóstico y el tratamiento de una infección por parvovirus o una enfermedad asociada con la misma.

La solución a dicho problema técnico se logra proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Tras la inmunización de ratones Balb/c con parvovirus H-1, pudieron aislarse células B que producen anticuerpos del bazo y fusionarse con células de mieloma Ag8 por los inventores. Tras tres rondas de selección usando presión de selección, pudo aislarse la línea celular de hibridoma BL-H1 que produce un anticuerpo monoclonal dirigido contra parvovirus H-1.

Por tanto, la presente invención proporciona anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una cápsida de parvovirus H-1 llena o vacía, uniéndose dicho anticuerpo o fragmento de unión a 65 antígeno del mismo sólo a una cápsida de parvovirus H-1 nativa pero no a proteínas de la cápsida de parvovirus H-1 desnaturalizadas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión del mismo que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica. Se producen fragmentos de unión (a antígeno) mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión química o enzimática de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab’, F (ab’) 2, Fv y anticuerpos de cadena sencilla así como “diacuerpos”. Se entiende que un anticuerpo distinto de un anticuerpo “biespecífico” o “bifuncional” tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos.

El término “cápsida” tal como se usa en el presente documento es el recubrimiento protector de proteína que rodea al ácido nucleico viral que se forma a partir de subunidades proteicas diferentes o idénticas denominadas capsómeros. La cápsida producida a partir de proteínas codificadas por el genoma viral y su conformación sirve como base para la distinción morfológica. Las subunidades proteicas codificadas por los virus se autoensamblarán formando una cápsida, lo que requiere generalmente la presencia del genoma del virus. La cápsida de parvovirus consiste en las proteínas VP1, VP2 y VP3 como parte de la maduración de partículas llenas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cápsida llena” se refiere a una cápsida de parvovirus que contiene el ácido nucleico viral, preferiblemente un virus viable. El término “cápsida vacía” se refiere a una cápsida sin ácido nucleico incrustado.

El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) que se une a una cápsida de parvovirus H-1 nativa pero no a una cápsida desnaturalizada, por ejemplo, una cápsida desnaturalizada mediante el uso de un detergente o calor.

En una realización más preferida, el anticuerpo de la presente invención (o un fragmento de unión a antígeno del

mismo) es un anticuerpo neutralizante. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo neutralizante” significa un anticuerpo que reduce o suprime la actividad biológica del parvovirus, por ejemplo, la replicación y/o infectividad.

En una realización incluso más preferida, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo monoclonal. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a parvovirus H-1 usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen la técnica de hibridoma, la técnica de hibridoma de células B humanas y la técnica de hibridoma de VEB (Kohler et al., Nature 256 (1985) , 495-7) . Puede usarse una cápsula completa, VP1, VP2, VP3 o fragmentos de las mismas para inmunizar un mamífero, tal como un ratón, una rata, un conejo, una cobaya, un mono o un ser humano, para producir anticuerpos policlonales. Si se desea, el inmunógeno puede conjugarse con una proteína portadora, tal como albúmina sérica bovina, tiroglobulina y hemocianina de lapa californiana. Dependiendo de la especie huésped, pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica.... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una cápsida de parvovirus H-1 llena o vacía, uniéndose dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo sólo a una cápsida de 5 parvovirus H-1 nativa pero no a proteínas de la cápsida de parvovirus H-1 desnaturalizadas.

2. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, que es un anticuerpo neutralizante.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, que es un anticuerpo monoclonal.

4. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 3, que se produce mediante la línea celular de hibridoma BL-H1 que se ha depositado en la DSMZ con el número ACC3030.

5. Anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, que se une al mismo epítopo que el anticuerpo según la reivindicación 4.

6. Anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, que compite por la unión a una cápsida de parvovirus H-1 llena o vacía con el anticuerpo según la reivindicación 4. 20

7. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que porta un marcador detectable.

8. Línea celular que produce un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de 25 las reivindicaciones 1 a 7.

9. Línea celular según la reivindicación 8, que es la línea celular de hibridoma BL-H1 que se depositó en la DSMZ con el número ACC3030.

10. Ácido nucleico, que codifica para un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6.

11. Composición de diagnóstico que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7. 35

12. Uso de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el diagnóstico in vitro de una infección por parvovirus.

13. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una 40 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, para su uso en un método para el tratamiento de una infección por parvovirus H-1 o una enfermedad provocada por dicha infección.

15. Uso de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una infección por parvovirus H-1 o una enfermedad provocada por dicha infección.

16. Kit útil para el diagnóstico o la terapia de una infección por parvovirus H-1 o una enfermedad provocada por dicha infección que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.

17. Kit según la reivindicación 16, que comprende además al menos un tampón.