Animales transgénicos para evaluar el metabolismo y la toxicidad de un fármaco.

Un ratón transgénico, o tejido o células derivados del mismo, que incorporan en su genoma al menos unasecuencia de ADN humano que codifica al menos un factor de transcripción que está bajo el control de un promotordel factor de transcripción y cuyos genes endógenos equivalentes se han anulado, incorporando adicionalmente elratón, los tejidos o las células derivados del mismo, al menos una o más de las siguientes secuencias de ADNhumano adicionales seleccionadas del grupo que comprende:

(i) una secuencia de ADN que codifica una enzima metabolizante de fármacos de fase 1;

(ii) una secuencia de ADN que codifica una enzima metabolizante de fármacos de fase 2; y/o

(iii) una secuencia de ADN que codifica una proteína transportadora de fármacos

y cuyo gen o genes equivalentes endógenos se han anulado;

en el que la secuencia humana que codifica al menos un factor de transcripción se inserta en el punto del genomaen el que existe de modo natural el gen endógeno equivalente; y

en el que el factor de transcripción se selecciona del grupo que comprende el receptor de pregnano X (PXR/SXR) yel receptor constitutivo de androstano (CAR) o una combinación de los mismos.

Animales transgénicos para evaluar el metabolismo y la toxicidad de un fármaco

La presente invención se refiere a ratones transgénicos, o tejidos o células derivados de los mismos, y a procedimientos para producirlos. Los ratones transgénicos, o tejidos o células derivados de los mismos, proporcionan un sistema capaz de expresar proteínas humanas responsables del metabolismo de fármacos en el lugar de las proteínas de ratón endógenas homólogas y de la expresión controlada de genes humanos introducidos en el animal de tal manera que la expresión de los genes humanos se regula de una manera más fielmente análoga a la observada in vivo en seres humanos. Los ratones transgénicos, o tejidos o células derivados de los mismos, son para usar, especialmente pero no exclusivamente, en la evaluación del metabolismo, la toxicidad u otras propiedades de las sustancias xenobióticas o de fármacos o funciones de las proteínas humanas introducidas tales como el metabolismo y/o la síntesis de los compuestos endógenos.

Antecedentes de la invención

Una proporción significativa de candidatos farmacológicos terapéuticos no llegan a ser fármacos comerciales debido al metabolismo adverso o a la toxicidad descubiertos durante los estudios clínicos. Estos fracasos representan un derroche muy significativo de costes en desarrollo y por consiguiente existe una necesidad de nuevas tecnologías que puedan predecir de forma más fiable, rápida y económica, en la fase de desarrollo preclínico, las características metabólicas y toxicológicas de candidatos farmacológicos en seres humanos. Hasta ahora, la mayoría de los ensayos metabólicos y de toxicidad clínicos de candidatos farmacológicos se basan en líneas celulares y/o en tejidos en cultivo de animales de laboratorio, seres humanos y/o mamíferos. Sin embargo, ninguno de estos procedimientos es completamente fiable en la predicción del metabolismo o toxicidad en un sujeto humano. Los datos metabólicos y toxicológicos procedentes de animales pueden diferir significativamente de los obtenidos frente a un sujeto humano debido a las diferencias de especies en los mecanismos bioquímicos implicados. Además, la interpretación de los datos derivados de estudios de tejidos humanos aislados o cultivos de células humanas in vitro pueden ser problemáticos ya que tales sistemas no están disponibles en todos los órganos y tejidos o no conservan las mismas características metabólicas a las que poseen in vivo.

En la técnica anterior se sabe que el metabolismo, la distribución y la toxicidad de la mayoría de los fármacos depende de sus interacciones con cuatro clases distintas de proteínas principales:

a) enzimas metabolizantes de fármacos de fase 1, tales como los citocromos P450 que generalmente añaden o exponen grupos polares en la molécula xenobiótica;

b) enzimas metabolizantes de fármacos de fase 2, tales como transferasas, en particular las glucuronil transferasas, glutatión transferasas, sulfonil transferasas y acetil transferasas que conjugan la molécula xenobiótica polarizada con un grupo hidrófilo facilitando así su excreción posterior;

c) proteínas transportadoras de fármacos, tales como las proteínas de casete de unión a ATP que incluyen las proteínas de resistencia a múltiples fármacos (MDR, Multi-Drug Resistance) y proteínas asociadas a una resistencia a múltiples fármacos (MRP, Multi-Drug Resistance-associated Proteins) y los polipéptidos de transporte de aniones orgánicos (OATP, Organic Anion Transporting Polypeptides) que facilitan el transporte de fármacos y de otras moléculas xenobióticas a través de las membranas plasmáticas;

d) factores de transcripción, tales como el receptor de pregnano X (PXR) y el receptor constitutivo de androstano (CAR) que regula la transcripción de los genes que codifican las proteínas de las clases anteriores, en particular los citocromos P450.

La variación entre especies se conoce en cada una de estas clases de proteínas con respecto a la multiplicidad de las proteínas dentro de cada clase, la función de las propias proteínas y con respecto a la regulación genética de su expresión.

A partir del documento WO2004/007708 se sabe cómo producir animales transgénicos no humanos que expresen los P450 humanos en los que el funcionamiento de los citocromos P450 endógenos se ha anulado por supresión de genes P450 individuales o por supresión del gen citocromo P450 reductasa que codifica la enzima sobre la que depende la función de todos los citocromos P450. Sin embargo, el modelo animal descrito tiene limitaciones ya que no sólo los P450 introducidos están limitados a órganos o a tejidos particulares del animal no humano sino que tampoco existe ninguna disposición para regular la expresión de los P450 humanos de una manera que sea análoga a la observada en seres humanos. Uno de los modelos de la técnica anterior también está limitado ya que se necesitan modificaciones adicionales para proporcionar actividad citocromo P450 reductasa a los P450 humanos introducidos sin reactivación de los P450 no humanos endógenos. Una desventaja adicional reside en la ausencia de provisión para reproducir el metabolismo de fase 2 humano, por tanto el sistema es incapaz de proporcionar un perfil metabólico completo.

También se sabe de la técnica anterior humanizar la características de inducción de los citocromos P450 en el ratón expresando el PXR humano (Xie y col., Nature Vol 406, 435-9, 2000) o el CAR humano (Zhang y col., Science Vol

298, 422-4, 2002) en un ratón en el que se ha eliminado gen PXR de ratón y/o el gen CAR de ratón respectivamente. Aunque dichos animales demuestran patrones de inducción de los P450 endógenos que reproducen los observados en los seres humanos tienen características no deseables porque los citocromos P450, cuya expresión está regulada análogamente a la de los seres humanos, aún son citocromos P450 no humanos. Una desventaja adicional es que debido a que los propios genes PXR o CAR no están regulados como lo están en los seres humanos en virtud del transgen dirigido por un promotor específico tisular heterólogo (promotor de albúmina) , puede ocurrir que la sobreexpresión del gen heterólogo pueda tener el resultado que se desvíe una ruta metabólica normal. Además, los transgenes PXR y CAR derivan de un ADNc en lugar de un clon genómico, por tanto consecuentemente los animales no humanos transgénicos no tienen las secuencias necesarias para reproducir correctamente toda la regulación transcripcional y post-transcripcional de la expresión de PXR o CAR dado que su expresión está limitada al hígado y puede no ser de un nivel fisiológico. Además estos modelos no codifican variantes de corte y empalme de los genes humanos. Otro inconveniente de los modelos PXR/CAR es que no son adecuados para combinar con modificaciones de otros genes dentro de un animal ya que la humanización de cada gen se consigue mediante dos modificaciones genómicas independientes: (i) inactivación del gen endógeno (ii) transgénesis con el ortólogo humano bajo el control del promotor de albúmina en una localización genómica diferente.

Existe por lo tanto necesidad de mejorías en los modelos animales del metabolismo humano que puedan controlar la expresión de genes humanos introducidos en el animal de manera que su expresión se regule de una manera más fielmente análoga a la observada en seres humanos. También existe necesidad de que se reproduzcan más aspectos de la ruta metabólica humana. Los modelos animales eficaces del metabolismo humano no solo requieren la expresión de las proteínas humanas relevantes sino también la anulación de las funciones de las proteínas endógenas homólogas.

Una razón de por qué la presente invención representa un sorprendente avance sobre la técnica anterior es porque muchos investigadores de la técnica anterior parecían opinar que ya estaba resuelto el problema de plantear la necesidad de modelos del metabolismo de fármacos. Por ejemplo, Xie y Evans (2002, DDT7, p509) afirman que la humanización de PXR es “uno de los raros ejemplos en los que el reemplazo de un solo regulador transcripcional permite la conversión de la regulación de genes específicos de especies”. Adicionalmente, es evidente que los profesionales han dirigido su atención a técnicas que difieren notablemente de las que usan sistemas con animales transgénicos. Por ejemplo, se realizaron intentos para humanizar el hígado de ratón como un órgano usando hepatocitos humanos, siendo el objetivo obtener... [Seguir leyendo]

1. Un ratón transgénico, o tejido o células derivados del mismo, que incorporan en su genoma al menos una secuencia de ADN humano que codifica al menos un factor de transcripción que está bajo el control de un promotor del factor de transcripción y cuyos genes endógenos equivalentes se han anulado, incorporando adicionalmente el ratón, los tejidos o las células derivados del mismo, al menos una o más de las siguientes secuencias de ADN humano adicionales seleccionadas del grupo que comprende:

(i) una secuencia de ADN que codifica una enzima metabolizante de fármacos de fase 1;

(ii) una secuencia de ADN que codifica una enzima metabolizante de fármacos de fase 2; y/o

(iii) una secuencia de ADN que codifica una proteína transportadora de fármacos

y cuyo gen o genes equivalentes endógenos se han anulado; en el que la secuencia humana que codifica al menos un factor de transcripción se inserta en el punto del genoma en el que existe de modo natural el gen endógeno equivalente; y en el que el factor de transcripción se selecciona del grupo que comprende el receptor de pregnano X (PXR/SXR) y el receptor constitutivo de androstano (CAR) o una combinación de los mismos.

2. Un ratón transgénico, o tejido o células derivadas del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el ADN humano que codifica un factor de transcripción comprende tanto el receptor de pregnano X (PXR) como el receptor constitutivo de androstano (CAR) .

3. Un ratón transgénico, o tejido o células derivados del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ADN humano que codifica una enzima metabolizante de fármacos de fase 1 se selecciona del grupo que comprende los citocromos P450.

4. Un ratón transgénico, o tejido o células derivados del mismo, de acuerdo con la reivindicación 3 en el que el P450 comprende una cualquiera o más de las siguientes isoformas: CYP3A4, CYP2C9, CYP2C 19, CYP2D6, CYP1A2, CYP2C8 y CYP2B6.

5. Un ratón transgénico, o tejido o células derivados del mismo, de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que el ADN humano que codifica una enzima metabolizante de fármacos de fase 1 comprende los grupos génicos CYP3A y/o CYP2C.

6. Un ratón transgénico, o tejido o células derivados del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el ADN humano que codifica una enzima metabolizante de fármacos de fase 2 comprende una cualquiera o más de las transferasas seleccionadas del grupo que comprende una glucuronil transferasa, una glutatión transferasa, una sulfonil transferasa y una acetil transferasa.

7. Un ratón transgénico, o tejido o células derivados del mismo, de acuerdo con la reivindicación 6 en el que el ADN humano que codifica una enzima metabolizante de fármacos de fase 2 comprende el grupo génico UGT1A.

8. Un ratón transgénico, o tejido o células derivados del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ADN humano que codifica una proteína transportadora de fármacos se selecciona del grupo que comprende una proteína de casete de unión a ATP, proteínas de resistencia a múltiples fármacos, proteínas asociadas a una resistencia a múltiples fármacos o polipéptidos de transporte de aniones orgánicos.

9. Un ratón transgénico, o tejido o células derivados del mismo, de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el ADN humano que codifica una proteína transportadora de fármacos codifica las proteínas MDR1 o MRP2.

10. Un ratón transgénico, o tejido o células derivados del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las secuencias de ADN humano incluyen secuencias codificantes unidas operativamente a secuencias de ADN humano reguladoras.

11. Un ratón transgénico, o tejido o células derivados del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que incorpora:

(i) una secuencia de ADN humano que codifica un factor de transcripción PXR y/o uno CAR

(ii) una secuencia de ADN humano que codifica la enzima CYP3A4; y

(iii) una secuencia de ADN humano que codifica la proteína MDR1.

12. Un ratón transgénico, o tejido o células derivados del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que un promotor del factor de transcripción y/o una enzima metabolizante de fármacos de fase 1 y/o de fase 2 y/o una proteína transportadora de fármacos está unido a un indicador que permite controlar la regulación relativa de al menos una enzima implicada en una disposición de fármaco/sustancia xenobiótica.

13. Un procedimiento de introducción de al menos un factor de transcripción humano funcional en una célula de ratón en la que su propio gen (genes) endógeno (s) equivalente (s) , que expresa (n) la proteína citada anteriormente,

se ha (n) vuelto inactivo (s) , incorporando adicionalmente la célula de ratón derivada del mismo al menos una o más de las siguientes secuencias de ADN humano adicionales seleccionadas del grupo que comprende:

(i) una secuencia de ADN que codifica una enzima metabolizante de fármacos de fase 1;

(ii) una secuencia de ADN que codifica una enzima metabolizante de fármacos de fase 2; y/o

(iii) una secuencia de ADN que codifica una proteína transportadora de fármacos

y cuyos propios genes endógenos equivalentes que expresan las proteínas antes citadas se han vuelto inactivos; comprendiendo el procedimiento la introducción de los ADN que codifican dicho factor de transcripción humano, dicha enzima metabolizante de fármacos de fase 1 y 2 y/o dicha proteína transportadora de fármacos de tal manera que dichos productos de expresión humanos permanecen funcionales donde los propios genes endógenos de la célula de ratón se han vuelto inactivos y en el que los genes de ratón cuyos productos proteicos son análogos a los productos proteicos de las secuencias de ADN humano introducidas se suprimen bien por direccionamiento directo con sus homólogos humanos o bien flanqueando estos genes o grupos génicos con sitios de reconocimiento y posterior supresión mediada por una recombinasa, de tal manera que la secuencia de ADN humano se inserta en el punto en el genoma en el que existe de modo el gen endógeno equivalente; y en el que la célula se humaniza para los PXR y CAR individualmente o en combinación.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que los genes humanos están al menos parcialmente conservados dentro de una construcción.

15. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-14, en el que la construcción PXR conserva la estructura de intrón-exón entre los exones 4 y 6.

16. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-15 en el que la construcción CAR conserva la estructura de intrón-exón entre los exones 2 y 9.

17. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que la célula de ratón se produce de novo.

18. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17 en el que las secuencias de ADN se suprimen por direccionamiento directo con sus homólogos humanos o flanqueando estos genes o grupos génicos con sitios de reconocimiento y posterior supresión mediada por una recombinasa.

19. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18 que comprende adicionalmente la etapa de introducción de una secuencia de ADN de un gen indicador de tal manera que los productos de expresión puedan medirse evaluando los productos de transcripción o de traducción.

20. Uso de un ratón transgénico, tejidos y/o células de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para investigar el metabolismo o la toxicidad de una sustancia xenobiótica en dichos ratón transgénico, tejidos y/o células derivadas del mismo, o el metabolismo y/o la biosíntesis de compuestos endógenos; para investigar el funcionamiento y la regulación de mecanismos humanos del metabolismo, la disposición y la toxicidad de sustancias xenobióticas a estudiar en tracto gastrointestinal, barrera hematoencefálica, hígado, riñón en un solo animal, tejido o célula derivada del mismo; para investigar los efectos del metabolismo, la disposición o la toxicidad humana sobre los efectos antitumorales de un fármaco en un experimento de xenoinjerto en un ratón, expresando vías metabólicas humanizadas en una línea de células tumorales injertadas de ratón y/o en el animal hospedador murino.

FIG. 1

FIG. 5 (Mdr1b)

P-GP (ABCB1b = MDR1b = MDR1) cóntigo genómico de ratón en el cromosoma 5