Un procedimiento para analizar el contenido en sacáridos de una composición,

(a) la composición comprende un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis ; y/o (ii) un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis; (b) el procedimiento comprende una etapa de analizar el contenido en ácido siálico de la composición, y (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, una etapa de analizar el contenido en galactosa de la composición; (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, una etapa de analizar el contenido en glucosa de la composición; (c) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, el contenido en sacárido del serogrupo W135 en la composición se determina de acuerdo con los resultados del análisis de galactosa de la etapa (b); (d) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, el contenido en sacárido del serogrupo Y en la composición se determina de acuerdo con los resultados del análisis de glucosa de la etapa (b); y (e) el contenido en sacáridos del serogrupo C en la composición se determina comparando los resultados del análisis de ácido siálico con: (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135 pero no un sacárido del serogrupo Y, los resultados del análisis de galactosa de la etapa (b); (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y pero no un sacárido del serogrupo W135, los resultados del análisis de glucosa de la etapa (b); o (iii) si la composición incluye tanto un sacárido del serogrupo W135 como un sacárido del serogrupo Y, los resultados combinados de los análisis de glucosa y galactosa de la etapa (b)

CAMPO TÉCNICO

La presente invención pertenece al campo del análisis y control de calidad de vacunas que incluyen sacáridos capsulares bacterianos, y en particular aquellas en las que los sacáridos están conjugados a un vehículo.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Los inmunogenes que comprenden antígenos de sacáridos capsulares conjugados a proteínas vehículo son bien conocidos en la técnica. La conjugación convierte antígenos T independientes en antígenos T dependientes, potenciando de ese modo respuestas de memoria y permitiendo el desarrollo de inmunidad protectora, y la vacuna del conjugado prototipo era para Haemophilus influenzae tipo b (Hib) [por ejemplo, véase capítulo 14 de ref. 1]. Desde la vacuna de Hib, se han desarrollado vacunas de sacáridos conjugados para proteger frente a Neisseria meningitidis (meningococcus) y frente a Streptococcus pneumoniae (pneumococcus). Otros organismos en los que las vacunas de conjugados son de interés son Streptococcus agalactiae (streptococcus grupo B) [2], Pseudomonas aeruginosa [3] y Staphylococcus aureus [4].

Las vacunas conjugadas para el serogrupo C de N. meningitidis se han aprobado para uso humano, e incluyen Menjugate™ [5], Meningitec™ y NeisVac–C™. Se han reseñado las mezclas de conjugados de cada uno de los serogrupos A, C, W135 e Y [por ejemplo referencias 6 – 9], incluyendo el producto Menactra™. Otras mezclas de antígenos conjugados incluyen: (i) mezclas de meningococos A/C [10, 11]; (ii) el producto PrevNar™ [12] que contiene siete conjugados de pneumococos; (iii) conjugados de meningococos e Hib mezclados [13, 14]; y (iv) conjugados de meningococos, pneumococos e Hib combinados [15].

Los temas cuando se tratan con vacunas conjugadas incluyen estabilidad y consistencia por lotes. En las vacunas de Hib, por ejemplo, se ha reseñado la despolimerización catalítica del sacárido [16], y los conjugados de la cápsula de meningococos del serogrupo A se hidrolizan rápidamente [17]. La inestabilidad de los conjugados conduce de forma no deseada a una reducción en la dosis efectiva del conjugado inmunogénico sobre el tiempo, variación entre lotes, y aumenta los niveles de productos de descomposición no caracterizados. Las referencias 18 y 19 estudian temas que se refieren al análisis de la estabilidad de vacunas conjugadas de Hib.

El análisis cuantitativo de glucoconjugados implica típicamente una primera etapa de hidrólisis de sacáridos, estando basado entonces el análisis en los monosacáridos liberados.

Aunque este análisis es relativamente sencillo para conjugados individuales (por ejemplo, se han usado procedimientos cromatográficos de intercambio de aniones para analizar conjugados hidrolizados de Hib [20] y serogrupo A de meningococos [21]), la situación es más compleja en vacunas de combinación, en particular cuando los diferentes sacáridos comparten unidades de monosacáridos. Por ejemplo, los sacáridos capsulares de los serogrupos C, W135 e Y de meningococos contienen todos ácido siálico, por lo que cualquier procedimiento basado en la medición de ácido siálico liberado no será capaz de distinguir los tres serogrupos.

Es un objeto de la invención proporcionar mejoras en la evaluación cuantitativa de sacáridos en vacunas conjugadas para evaluar la estabilidad e integridad. En particular, es un objeto proporcionar procedimientos que se puedan usar para medir conjugados individuales dentro de vacunas conjugadas de meningococos combinados, y de ese modo proporcionar mejoras en el control de calidad y consistencia de la vacuna.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención está basada en procedimientos que permiten el análisis de sacáridos de meningococo mezclados a partir de múltiples serogrupos aun cuando los sacáridos comparten unidades de monosacáridos. De ese modo, la invención proporciona un procedimiento para analizar el contenido en sacáridos de una composición en la que:

(a) la composición comprende un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis ; y/o (ii) un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis;

(b) el procedimiento comprende una etapa de analizar el contenido en ácido siálico de la composición, y (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, una etapa de analizar el contenido en galactosa de la composición; (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, una etapa de analizar el contenido en glucosa de la composición;

(c) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, el contenido en sacárido del serogrupo W135 en la composición se determina de acuerdo con los resultados del análisis de galactosa de la etapa (b);

(d) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, el contenido en sacárido del serogrupo Y en la composición se determina de acuerdo con los resultados del análisis de glucosa de la etapa (b);

(e) el contenido en sacáridos del serogrupo C en la composición se determina comparando los resultados del análisis de ácido siálico con: (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135 pero no un sacárido del serogrupo Y, los resultados del análisis de galactosa de la etapa (b); (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y pero no

un sacárido del serogrupo W135, los resultados del análisis de glucosa de la etapa (b); o (iii) si la composición incluye tanto un sacárido del serogrupo W135 como un sacárido del serogrupo Y, los resultados combinados de los análisis de glucosa y galactosa de la etapa (b).

Con una combinación de sacáridos de los serogrupos C, W135 e Y, por lo tanto, la invención analiza el contenido en ácido siálico, glucosa y galactosa. Los resultados de glucosa y galactosa se usan para cuantificar directamente los sacáridos de los serogrupos Y y W135, respectivamente, y el contenido combinado en glucosa y galactosa se sustrae del contenido en ácido siálico para cuantificar los sacáridos del serogrupo C. Los tres serogrupos se pueden resolver de este modo aun cuando el contenido en monosacáridos se solape. Los inventores han descubierto de forma ventajosa que los tres análisis de monosacáridos diferentes se pueden realizar sobre el mismo material, sin interferencia entre los monosacáridos y sin interferencia de cualquier otro material sacarídico en la composición (por ejemplo, estabilizantes de liofilización). El procedimiento se puede usar para analizar el sacárido libre y total en las vacunas conjugadas y simplifica el control de calidad de las vacunas que contienen sacáridos capsulares de serogrupos múltiples.

Se ha descrito un procedimiento para analizar mezclas de aldosa, hexosamina y ácido siálico sin interferencia [22], pero está basado en tratamientos enzimáticos y derivación química. Por el contrario, el procedimiento de la invención no requiere tales etapas y por eso es más rápido y fácil de realizar. Además, la situación tratada en la referencia 22 no padece el problema inherente de tener que resolver diferentes sacáridos que compARTEN unidades de monosacáridos comunes.

La invención también proporciona un aparato informático adaptado para realizar un procedimiento de la invención. En particular, la invención proporciona un programa informático para analizar el contenido en sacáridos de una composición como se define anteriormente, que comprende un módulo de programa para: (a) recibir datos sobre el contenido en ácido siálico, y sobre el contenido en glucosa y/o galactosa, de una muestra; y (b) calcular a partir de esos datos el contenido en sacáridos capsulares del serogrupo C y del serogrupo W135 y/o Y. La invención también proporciona un producto de programa informático que comprende un medio de almacenamiento de lectura informático que tiene almacenado en el mismo el programa informático de la invención.

Los sacáridos capsulares de los serogrupos C, W135 e Y

Los procedimientos de la invención son para analizar mezclas de sacáridos capsulares de meningococos. Las mezclas incluyen los sacáridos capsulares de (i) serogrupo C y (ii) uno de o ambos serogrupos W135 e Y, es decir, C+W135, C+Y, o C+W135+Y. También pueden

estar presentes sacáridos adicionales.

El sacárido capsular del serogrupo C es un homopolímero del ácido siálico alineado con (α2→9) (ácido neuramínico N–acetilo, o ‘NeuNAc'). La mayor parte de las cepas del serogrupo C tienen grupos O–acetilo en C–7 y/o...

1. Un procedimiento para analizar el contenido en sacáridos de una composición, en el que:

(a) la composición comprende un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis ; y/o (ii) un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis;

(b) el procedimiento comprende una etapa de analizar el contenido en ácido siálico de la composición, y (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, una etapa de analizar el contenido en galactosa de la composición; (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, una etapa de analizar el contenido en glucosa de la composición;

(c) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135, el contenido en sacárido del serogrupo W135 en la composición se determina de acuerdo con los resultados del análisis de galactosa de la etapa (b);

(d) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y, el contenido en sacárido del serogrupo Y en la composición se determina de acuerdo con los resultados del análisis de glucosa de la etapa (b); y

(e) el contenido en sacáridos del serogrupo C en la composición se determina comparando los resultados del análisis de ácido siálico con: (i) si la composición incluye un sacárido del serogrupo W135 pero no un sacárido del serogrupo Y, los resultados del análisis de galactosa de la etapa (b); (ii) si la composición incluye un sacárido del serogrupo Y pero no un sacárido del serogrupo W135, los resultados del análisis de glucosa de la etapa (b); o

(iii) si la composición incluye tanto un sacárido del serogrupo W135 como un sacárido del serogrupo Y, los resultados combinados de los análisis de glucosa y galactosa de la etapa (b).

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la composición comprende el sacárido capsular de todos los tres serogrupos C, W135 e Y de Neisseria meningitidis.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la composición comprende uno o más sacáridos capsulares adicionales.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que uno o más sacáridos capsulares adicionales se seleccionan del grupo que consiste en: un sacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis; y un sacárido capsular de Haemophilus influenzae b.

5. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que incluye una etapa de tratar la composición con el fin de despolimerizar los sacáridos capsulares para proporcionar sus monosacáridos constituyentes.

6. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el contenido en ácido siálico, el contenido en glucosa y/o el contenido en galactosa se miden por medio de cromatografía de intercambio de aniones de alto rendimiento, opcionalmente con detección amperométrica pulsada.

7. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el procedimiento también incluye la(s) etapa(s) en la(s) que uno o más de los siguientes componentes o propiedades se analiza(n): osmolaridad, pH, grado de polimerización para sacáridos o conjugados individuales, contenido en proteínas, contenido en aluminio, contenido en detergente, y contenido en conservante.

8. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que los sacáridos capsulares se derivan de un conjugado de sacárido -proteína.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la proteína en el conjugado es una toxina o toxoide bacteriano.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la toxina o toxoide se seleccionan del grupo que está constituido por: toxoide diftérico; toxoide tetánico; el derivado de la toxina diftérica CRM197; y la proteína D de H. influenzae.

11. Un procedimiento para analizar una composición, en el que:

(a) la composición comprende un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis y uno o ambos de: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; y/o (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis;

(b) la composición puede comprender los sacáridos capsulares en forma no conjugada;

(c) el contenido de cualquier sacárido capsular no conjugado se determina por medio del procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;

(d) el contenido de sacáridos capsulares conjugados se determina por medio del procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;

y, opcionalmente:

(e) la relación de sacárido conjugado:no conjugado en la composición se calcula para uno o más de los sacáridos capsulares.

12. Un aparato ordenador adaptado para realizar el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Un programa de ordenador para analizar el contenido en sacáridos de una composición como se define en la reivindicación 1, que comprende un módulo de programa para: (a) recibir datos sobre el contenido en ácido siálico, y sobre el contenido en glucosa y/o galactosa, de una muestra; y (b) calcular a partir de esos datos el contenido en sacáridos capsulares del serogrupo C y del serogrupo W135 y/o Y.