Un procedimiento para una amplificación de ácidos nucleicos ciclados térmicamente,

que incluye una reacción de polimerasa de una plantilla de ácido nucleico, un cebador, una polimerasa de ácido nucleico y al menos un polifosfato de nucleósido, comprendiendo la mejora realizar dicha reacción de polimerasa en presencia de al menos un polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal, y además en el que la amplificación se realiza en presencia de una concentración adecuada de un estabilizador seleccionado entre el grupo sulfato de amonio, sulfato de magnesio, cloruro de amonio, molibdato sódico, tungstato sódico, que estabiliza el polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal frente a hidrólisis no enzimática

Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/445.274, presentada el 5 de febrero de 2003. Campo de la Invención

La presente invención se refiere, en general, a amplificación de ácidos nucleicos. Más específicamente, la presente invención se refiere al uso de nucleótidos marcados en el fosfato terminal en la amplificación de ácidos nucleicos. Antecedentes de la Invención

Se conocen procedimientos para detectar ácidos nucleicos específicos o analitos en una muestra con gran especificidad y sensibilidad. Dichos procedimientos requieren generalmente amplificar primero la secuencia de ácidos nucleicos basándose en la presencia de una secuencia diana específica o analito. Después de la amplificación, se detectan y cuantifican las secuencias amplificadas. Los sistemas de detección convencionales para ácidos nucleicos incluyen detección de

Los nucleótidos marcados en el fosfato terminal proporcionan los beneficios anteriores. Por ejemplo, la incorporación de nucleótidos gamma- o delta- marcados en ADN o ARN por polimerasas de ácido nucleico da como resultado la producción de ADN o ARN no modificado y al mismo tiempo el pirofosfato marcado generado puede usarse para detectar, caracterizar y/o cuantificar la diana. Si estos pudieran usarse en reacciones de amplificación no sólo proporcionarían herramientas útiles para la detección y cuantificación de secuencia diana, sino que el producto amplificado, que es una copia exacta de la secuencia diana sin modificaciones, podría usarse en otros estudios.

La amplificación de ADN mediante varios procedimientos de amplificación se realiza a altas temperaturas. Por ejemplo, en PCR, ciclos repetidos de desnaturalización a 95ºC, hibridación alrededor de 60ºC y extensión alrededor de 70ºC provocan una degradación significativa de los dNTP. Esto puede afectar significativamente al rendimiento del producto en ciclos posteriores. Otros procedimientos de amplificación tales como RCA y NASBA, aunque son isotermos, también se realizan a temperaturas superiores. En el caso de NASBA, que se realiza a 41ºC, la estabilidad de los nucleótidos puede no ser muy crítica, sin embargo en RCA, que puede realizarse a una temperatura superior dependiendo de la polimerasa usada y de la complejidad de la secuencia a amplificar, la estabilidad de los nucleótidos puede ser una cuestión en estas condiciones. Si se produjera la degradación de los nucleótidos marcados en el fosfato terminal, la cantidad de fondo generado abrumaría cualquiera señal directamente relacionada con el proceso de amplificación. Por lo tanto, es deseable tener nucleótidos que puedan sobrevivir a esta ciclación repetida de temperatura o al calentamiento prolongado a una temperatura muy elevada constante y, por lo tanto, continúan proporcionando altos rendimientos de producto y un bajo fondo incluso en los últimos ciclos de amplificación y posiblemente acorten el número de ciclos/tiempo requerido para conseguir la amplificación deseable. Además, los nucleótidos marcados en el gamma-fosfato son sustratos extremadamente pobres para la polimerasa en las condiciones usadas normalmente para la síntesis de y amplificación de ácidos nucleicos. La síntesis de grandes tramos de ácidos nucleicos (longitudes de varios centenares a varios millares de bases) requeriría horas si no días por ciclo. Harding y col. (documento WO 0244425 A2) describen el uso de aminonaftalenosulfonato-gamma-amido-dATP para la síntesis de ADN a alta temperatura. Sin embargo, de acuerdo con los inventores, en este caso la síntesis sólo se desarrolla después de que el aminonaftalenosulfonato retire por hidrolización el nucleótido y es dATP el que se usa por la polimerasa para formar ADN. Por supuesto, esto es útil para la detección o cuantificación de secuencia diana ya que el tinte generado es independiente de la síntesis de ADN.

Se han desarrollado varios ensayos en tiempo real para la cuantificación de ADN. La mayoría de éstos pueden clasificarse en dos categorías. La primera categoría que es relativamente fácil de usar implica el uso de tintes de intercalación, que tienen una fluorescencia mejorada después de la intercalación. Varios colorantes de ácido nucleico tales como bromuro de etidio, tintes SYBR Green®, PicoGreen®, YOYO®, TOTO® o análogos se han desarrollado como intercaladores para ensayos en tiempo real. Éstos, sin embargo, generan una señal de fondo significativa debido parcialmente a la intercalación entre dímeros cebadores y parcialmente debido a que son fluorescentes, aunque débilmente, incluso cuando no están intercalados.

La otra categoría de ensayo en tiempo real se basa en el uso de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia entre un tinte y un inactivador. Varios de estos ensayos se han desarrollado usando sondas FRET y/o cebadores, tales como Taqman, MGB Eclipse™, cebadores Scorpion, balizas moleculares, cebadores sunrise, por nombrar algunos. Estas sondas/cebadores se inactivan por transferencia de energía hasta que se produce la amplificación y el inactivador se separa físicamente del tinte o se escinde. La sensibilidad de estos ensayos depende en gran medida del diseño de la sonda y requiere mucha optimización. Además, incluso con la sonda mejor optimizada, no se consigue una inactivación completa. Así que estos ensayos sólo pueden proporcionar una mejora de unas pocas veces en la señal después de la amplificación y en los ciclos iniciales la señal de fondo es mucho mayor que la señal verdadera.

Sería beneficioso, por lo tanto, desarrollar procedimientos de amplificación que usen polifosfatos de nucleósidos marcados en el fosfato terminal en los que la amplificación pueda realizarse en un tiempo razonable (similar a dNTP no modificados) y la cantidad de marcador generado sea proporcional al producto formado. También es deseable tener un ensayo en tiempo real, en el que la cantidad de marcador generada pueda detectarse independientemente sin interferencia de la señal del nucleótido marcado en el fosfato terminal. Sería deseable tener un ensayo en tiempo real en el que el marcador sea completamente oscuro hasta que se desarrolle una amplificación.

Sumario de la Invención

La presente invención proporciona procedimientos de uso de nucleótidos marcados en el fosfato terminal (también denominados polifosfatos de nucleósidos marcados en el fosfato terminal) en la amplificación de ácidos nucleicos. También se proporcionan procedimientos para la detección y cuantificación de una secuencia diana por amplificación selectiva. También se proporcionan procedimientos para la detección y cuantificación en tiempo real de una secuencia diana durante la amplificación. Todas las reacciones de amplificación que incluyen un nucleótido marcado en el fosfato terminal, también incluyen un estabilizador seleccionado entre sulfato de amonio, sulfato de magnesio, cloruro de amonio, molibdato sódico y tungstato sódico.

La presente invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico que incluye las etapas de: a) realizar una amplificación de ácido nucleico que incluye la reacción de un nucleótido marcado en el fosfato terminal, dando como resultado de reacción la producción de polifosfato marcado; b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie detectable; y c) detectar la presencia de la especie detectable. Una definición de fosfatasa en la presente invención incluye cualquier enzima que escinda monoésteres de fosfato, tioéster de fosfato, fosforamidato, polifosfatos y nucleótidos para liberar fosfato inorgánico. En el contexto de la presente invención, esta enzima no escinde un fosfato de nucleósido marcado terminalmente (es decir, el nucleótido marcado en el fosfato terminal es sustancialmente no reactivo a fosfatasa). La definición de fosfatasa proporcionada en el presente documento incluye específicamente, pero sin limitación, fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1) y fosfatasa ácida (EC 3.1.3.2). La definición de un nucleótido en la presente invención incluye un fosfato de nucleósido natural o modificado.

La presente invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico que incluye las etapas de: a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de una sal de manganeso, en la que la reacción incluye la reacción de un nucleótido marcado en el fosfato terminal, en la que la reacción da como resultado la producción...

1. Un procedimiento para una amplificación de ácidos nucleicos ciclados térmicamente, que incluye una reacción de polimerasa de una plantilla de ácido nucleico, un cebador, una polimerasa de ácido nucleico y al menos un polifosfato de nucleósido, comprendiendo la mejora realizar dicha reacción de polimerasa en presencia de al menos un polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal, y además en el que la amplificación se realiza en presencia de una concentración adecuada de un estabilizador seleccionado entre el grupo sulfato de amonio, sulfato de magnesio, cloruro de amonio, molibdato sódico, tungstato sódico, que estabiliza el polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal frente a hidrólisis no enzimática.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el estabilizador se selecciona entre molibdato sódico, tungstato sódico y sulfato de amonio.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2 en el que el estabilizador es molibdato sódico o tungstato sódico.

4. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que la amplificación se consigue por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

5. Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que la polimerasa de ácido nucleico es una ADN polimerasa arqueobacteriana.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la amplificación se realiza en presencia de dos o más polifosfatos de nucleósidos marcados en el fosfato terminal con distintos marcadores.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal comprende cuatro o más grupos fosfato en la cadena polifosfato.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho polifosfato de nucleósidos

**(Ver fórmula)**

en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo; n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo haloalquilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster, alquilfosfonato o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural o modificado; P-L es un marcador fosforilado.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicho polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal es un engarce entre P y L.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicho marcador fosforilado es un marcador activable por enzimas y se selecciona entre el grupo que consiste en compuestos quimioluminiscentes, tintes fluorogénicos, tintes cromogénicos, marcas de masa, marcas electroquímicas y combinaciones de los mismos.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho compuesto quimioluminiscente es un compuesto de 1,2-dioxoetano activado por fosfatasa alcalina.

12. Un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ácidos nucleicos en una muestra que comprende las etapas de:

(a) realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos ciclados térmicamente para generar un polifosfato marcado, incluyendo dicha reacción al menos un polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal, y una polimerasa de ácido nucleico en presencia de una concentración adecuada de un estabilizador que estabiliza el polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal frente a hidrólisis no enzimática; y en el que el estabilizador se selecciona entre sulfato de amonio, sulfato de magnesio, cloruro de amonio, molibdato sódico y tungstato sódico;

(b) detectar dicho polifosfato marcado, en el que dicha etapa de detección incluye (a) tratar dicho polifosfato marcado con una fosfatasa para producir una especie detectable; y (b) detectar dicha especie detectable.

13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 en el que el estabilizador se selecciona entre molibdato sódico, tungstato sódico y sulfato de amonio.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 en el que el estabilizador es molibdato sódico o tungstato sódico.

15. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha etapa de tratamiento y dicha etapa de realización se realizan simultáneamente.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicha etapa de detección se realiza en tiempo real según se produce dicha especie detectable.

17. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la amplificación se realiza por PCR.

18. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha etapa de realización se realiza por PCR, y dicha reacción también incluye cebadores específicos de alelo.

19. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal está representado por la fórmula:

en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo; n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador activable por enzimas que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural o modificado; P-L es un marcador fosforilado.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicho polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal contiene un engarce entre P y L.