Amplificación de ácidos nucleicos específica de alelo.

Un método de amplificación específica de alelo de una variante de una secuencia diana,

en el que la amplificación implica la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la secuencia diana puede existir en forma de varias secuencias variantes, comprendiendo el método

(a) hibridación de un primer y un segundo oligonucleótidos a la secuencia diana; en el que el primer oligonucleótido es al menos parcialmente complementario a la secuencia diana, y el segundo oligonucleótido es al menos parcialmente complementario sobre su porción 3' y 5' de la secuencia diana, y tiene al menos un nucleótido selectivo complementario a solo una variante de la secuencia diana, en el que dicho nucleótido selectivo se coloca 10 internamente del extremo 3', y en donde dicho segundo oligonucleótido comprende al menos un nucleótido con una base covalentemente modificada en el grupo amino exocíclico, en el que el grupo amino exocíclico es el grupo amino en la posición 6 de la adenosina, en la posición 2 de la guanosina o en la posición 4 de la citidina;

(b) proporcionar condiciones para la hibridación de dicho primer y segundo oligonucleótidos al menos a una variante de la secuencia diana, adecuada para la extensión del oligonucleótido por una polimerasa de ácido nucleico, en el que dicha polimerasa es capaz de extender dicho segundo oligonucleótido preferentemente cuando dicho segundo oligonucleótido se hibrida con dicha variante de la secuencia diana que es complementaria a dicho nucleótido selectivo, y sustancialmente menor cuando dicho segundo oligonucleótido se hibrida con dicha variante de la secuencia diana que no es complementaria a dicho nucleótido selectivo; y

(c) repetir la secuencia de pasos de hibridación y extensión múltiples veces.

Amplificación de ácidos nucleicos específica de alelo.

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

La invención se refiere al campo de la amplificación de ácidos nucleicos y, específicamente, al campo de la amplificación específica de alelo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 10

La amplificación de ácidos nucleicos específica de alelo permite la amplificación y análisis de la secuencia diana de forma simultánea. La amplificación específica de alelo se utiliza normalmente cuando el ácido nucleico diana tiene una o más variaciones (polimorfismos) en su secuencia. Los polimorfismos de ácido nucleico que se utilizan en el análisis del perfil de DNA (medicina forense, pruebas de paternidad, tipificación de tejidos para trasplantes de 15 órganos) , cartografía genética, distinguiendo entre las cepas patógenas de microorganismos, así como la detección de mutaciones raras, tales como las que ocurren en las células cancerosas, existente células con DNA normal.

US200707717118 A1 describe el uso de un cebador específico de alelo que tiene en su extremo 3' una base que es complementaria a la base variante predicha en la secuencia diana. WO03072814 A2 describe el uso de cebadores 20 discriminatorios que tienen uno o más nucleótidos sustituidos, en la posición 4' de la (desoxi) ribosa, para llevar a cabo una PCR específica de alelo.

En una amplificación específica de alelo con éxito, la variante deseada del ácido nucleico diana se amplifica, mientras que las otras variantes no se amplifican, al menos no a un nivel detectable. Un ensayo típico de 25 amplificación específica de alelo implica una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con al menos un cebador específico de alelo diseñado de tal manera que la extensión del cebador sólo se produce cuando el cebador forma un híbrido con la variante deseada de la secuencia diana. Cuando el cebador hibrida con una variante no deseada de la secuencia diana, la extensión del cebador se inhibe.

Se han propuesto muchas formas de aumentar la especificidad de alelo de los cebadores. Sin embargo, para muchas dianas de ácido nucleico clínicamente relevantes, la falta de especificidad de la PCR sigue siendo un problema. Por lo tanto son necesarios enfoques radicalmente nuevos para el diseño de cebadores específicos de alelo.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a un método de amplificación específica de alelo de una variante de una secuencia diana, la diana existe en forma de varias secuencias variantes, oligonucleótidos, equipos y mezclas de reacción para los mismos como se define por las reivindicaciones. 40

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra los resultados de la amplificación específica de alelo utilizando diversas polimerasas de ácidos nucleicos y cebadores con nucleótidos selectivos internos de acuerdo con la presente invención. 45

La Figura 2 muestra los resultados de la amplificación específica de alelo utilizando diversas polimerasas de ácidos nucleicos y con diversos cebadores con nucleótidos selectivos 3' como control.

La Figura 3 muestra los resultados de la amplificación específica de alelo utilizando diversas polimerasas de ácidos 50 nucleicos y diversos cebadores con nucleótidos selectivos internos de acuerdo con la presente invención, incluyendo cebadores que tienen un formato ARMS escorpión.

La figura 4 muestra una representación esquemática de la estructura de un formato de ARMS escorpión que se puede utilizar de acuerdo con la invención. 55

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizarán las siguientes definiciones.

El término "ácido nucleico" se refiere a polímeros de nucleótidos (por ejemplo, ribonucleótidos, 65 desoxirribonucleótidos, análogos de nucleótidos, etc.) y comprenden ácidos desoxiribonucleicos (DNA) , ácidos ribonucleicos (RNA) , híbridos DNA-RNA, oligonucleótidos, polinucleótidos, aptámeros, ácidos nucleicos peptídicos (PNA) , conjugados de PNA-DNA, conjugados de PNA-RNA, etc., que comprenden los nucleótidos covalentemente unidos entre sí, ya sea en forma lineal o ramificada. Un ácido nucleico normalmente es de cadena sencilla o de doble cadena y generalmente contendrá enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, se incluyen análogos de ácidos nucleicos que pueden tener cadenas principales alternativas, incluyendo, por ejemplo, fosforamida 5 (Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49 (10) :1925) ; fosforotioato (Mag et al (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; y la Patente US No. 5.644.048.) , fosforoditioato (Briu et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321) , uniones O-metilfosforoamidita (ver Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: a Practical Approach, Oxford University Press (1992) ) , y el esqueleto peptídico de ácidos nucleicos y enlaces (véase, Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895) . Estas modificaciones del esqueleto de ribosa-fosfato pueden realizarse para facilitar la adición de porciones 10 adicionales, tales como marcajes, o para alterar la estabilidad y la vida media de este tipo de moléculas en entornos fisiológicos.

Además de las bases heterocíclicas naturales que se encuentran típicamente en los ácidos nucleicos (por ejemplo, adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) , los análogos de nucleótidos pueden incluir también bases heterocíclicas 15 no naturales, tales como las descritas en, por ejemplo, Seela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82: 1640. Ciertas bases utilizadas en análogos de nucleótidos actúan como modificadores de la temperatura de fusión (Tm) . Por ejemplo, algunos de estos incluyen 7-deazapurinas (por ejemplo, 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, etc.) , pirazolo[3, 4-d] pirimidinas, propinilo-dN (por ejemplo, propinilo-dU, propinilo-dC, etc.) , y similares. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 5.990.303. Otras bases heterocíclicas representativas incluyen, por ejemplo, hipoxantina, inosina, 20 xantina; derivados de 2-aminopurina, 2, 6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; derivados 7-deaza-8-aza de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2, 6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; 6-azacitidina; 5-fluorocitidina; 5-clorocitidina; 5-yodocitidina; 5-bromocitidina; 5-metilcitidina; 5-propinilcitidina; 5-bromoviniluracilo; 5-fluorouracilo; 5-clorouracilo; 5-yodouracilo; 5-bromouracilo; 5-trifluorometiluracilo; 5-methoxymetiluracilo; 5-etiniluracilo; 5-propiniluracilo, y similares. 25

Un "molde de ácido nucleico", "molde" o "diana" se refiere a un ácido nucleico de interés al que un cebador puede hibridarse y extender en condiciones adecuadas. En el contexto de la amplificación del ácido nucleico, la "diana" es preferiblemente una región de ácido nucleico, que consiste de las secuencias al menos parcialmente complementarias con al menos dos secuencias de cebador y una secuencia de intervención. (Si la diana es un ácido 30 nucleico de cadena sencilla, consiste en una secuencia al menos parcialmente complementaria a un cebador y una secuencia al menos parcialmente idéntica al segundo cebador) . Los moldes de ácidos nucleico pueden existir como fragmentos de ácido nucleico aislados o ser una parte de un fragmento de ácido nucleico más grande. Los ácidos nucleicos diana pueden derivar o aislarse desde prácticamente cualquier fuente, como microorganismos cultivados, microorganismos no cultivados, mezclas biológicas complejas, tejidos, sueros, tejidos o muestras antiguas o 35 preservadas, aislados del medio ambiente o similares. Además, los moldes de ácidos nucleicos opcionalmente incluyen o derivan a partir de DNAc, RNA, DNA genómico, DNA genómico clonado, bibliotecas de DNA genómico, DNA fragmentado enzimáticamente o RNA, DNA fragmentado químicamente o RNA, DNA o RNA físicamente fragmentado, o similares. Los moldes de ácidos nucleicos también pueden sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas en la materia. 40

Un "oligonucleótido" se refiere a un polímero de ácido nucleico que incluye al menos dos, pero normalmente 5-50 nucleótidos y más normalmente, entre 15 y 35 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden prepararse por cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la clonación y digestión de restricción de secuencias apropiadas, o síntesis química directa por un método tal como el método del fosfotriéster de Narang et 45 al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; el método del fosfodiéster de Brown et al. (1979)... [Seguir leyendo]

1. Un método de amplificación específica de alelo de una variante de una secuencia diana, en el que la amplificación implica la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , la secuencia diana puede existir en forma de varias secuencias variantes, comprendiendo el método 5

(a) hibridación de un primer y un segundo oligonucleótidos a la secuencia diana; en el que el primer oligonucleótido es al menos parcialmente complementario a la secuencia diana, y el segundo oligonucleótido es al menos parcialmente complementario sobre su porción 3' y 5' de la secuencia diana, y tiene al menos un nucleótido selectivo complementario a solo una variante de la secuencia diana, en el que dicho nucleótido selectivo se coloca 10 internamente del extremo 3', y en donde dicho segundo oligonucleótido comprende al menos un nucleótido con una base covalentemente modificada en el grupo amino exocíclico, en el que el grupo amino exocíclico es el grupo amino en la posición 6 de la adenosina, en la posición 2 de la guanosina o en la posición 4 de la citidina;

(b) proporcionar condiciones para la hibridación de dicho primer y segundo oligonucleótidos al menos a una variante de la secuencia diana, adecuada para la extensión del oligonucleótido por una polimerasa de ácido nucleico, en el 15 que dicha polimerasa es capaz de extender dicho segundo oligonucleótido preferentemente cuando dicho segundo oligonucleótido se hibrida con dicha variante de la secuencia diana que es complementaria a dicho nucleótido selectivo, y sustancialmente menor cuando dicho segundo oligonucleótido se hibrida con dicha variante de la secuencia diana que no es complementaria a dicho nucleótido selectivo; y

(c) repetir la secuencia de pasos de hibridación y extensión múltiples veces. 20

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha polimerasa de ácido nucleico en el paso (b) es capaz de extender dicho segundo oligonucleótido exclusivamente cuando dicho nucleótido selectivo forma un par de bases con la diana.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicho nucleótido selectivo está entre 1 y 5 nucleótidos cerca del extremo 3' del oligonucleótido.

4. El método de la reivindicación 1, que comprende además un paso (d) de detección del producto de extensión del cebador en el paso (c) . 30

5. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha polimerasa de ácido nucleico se selecciona de un grupo que consiste de polimerasa de DNA Taq, polimerasa de DNA Z05, polimerasa de DNA ΔZ05 y polimerasa de DNA ΔZ05-Gold.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dicha polimerasa de ácido nucleico posee actividad nucleas.

3. 5'.

7. El método de la reivindicación 6, en el que dicha polimerasa de ácido nucleico se selecciona de un grupo que consiste en polimerasa de DNA Pfu y Thermatoga Maritima.

8. El método de la reivindicación 1, en el que dicha variante de la secuencia en el paso (a) es una mutación V600E del gen BRAF, EGFR, PIK3CA o KRAS humano.

9. El método de la reivindicación 1, en el que dicho primer oligonucleótido es Id. de Sec. nº : 11.

10. El método de la reivindicación 1, en el que dicho segundo oligonucleótido se selecciona de un grupo que consiste en Id. de Sec. nº : 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 y 17.

11. un método para detectar una variante de una secuencia diana, la secuencia diana existente en forma de varias secuencias variantes, comprendiendo el método: 50

(a) hibridación de un primer y un segundo oligonucleótidos a la secuencia diana; en el que el primer oligonucleótido es al menos parcialmente complementario a la secuencia diana, y el segundo oligonucleótido es al menos parcialmente complementario sobre su porción 3' y 5' de la secuencia diana, y tiene al menos un nucleótido selectivo complementario a solo una variante de la secuencia diana, en el que dicho nucleótido selectivo se coloca 55 internamente del extremo 3', y en donde dicho segundo oligonucleótido comprende al menos un nucleótido con una base covalentemente modificada en el grupo amino exocíclico, en el que el grupo amino exocíclico es el grupo amino en la posición 6 de la adenosina, en la posición 2 de la guanosina o en la posición 4 de la citidina;

(b) proporcionar condiciones para la hibridación de dicho primer y segundo oligonucleótidos al menos a una variante de la secuencia diana, adecuada para la extensión del oligonucleótido por una polimerasa de ácido nucleico, en el 60 que dicha polimerasa es capaz de extender dicho segundo oligonucleótido preferentemente cuando dicho segundo oligonucleótido se hibrida con dicha variante de la secuencia diana que es complementaria a dicho nucleótido selectivo, y sustancialmente menor cuando dicho segundo oligonucleótido se hibrida con dicha variante de la secuencia diana que no es complementaria a dicho nucleótido selectivo;

(c) repetir la secuencia de pasos de hibridación y extensión múltiples veces; y 65

(d) detectar los productos de dicha extensión de oligonucleótido, en el que la extensión significa la presencia de la variante de una secuencia diana a la que dicho segundo oligonucleótido posee un nucleótido selectivo complementario.

12. Un equipo para la amplificación específica de alelo de una secuencia diana, en el que la amplificación implica la 5 reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , dicha secuencia diana existente en forma de varias variantes de secuencia, el equipo comprende:

(a) un primer oligonucleótido, en menos parcialmente complementario a la secuencia diana;

(b) un segundo oligonucleótido, al menos parcialmente complementario sobre su porción 3' y 5' a la secuencia diana 10 que tiene al menos un nucleótido selectivo complementario a solo una variante de la secuencia diana, en el que dicho nucleótido selectivo se coloca internamente del extremo 3', y en donde dicho segundo oligonucleótido comprende al menos un nucleótido con una base covalentemente modificada en el grupo amino exocíclico, en el que el grupo amino exocíclico es el grupo amino en la posición 6 de la adenosina, en la posición 2 de la guanosina o en la posición 4 de la citidina; y 15

(c) una polimerasa de ácido nucleico, nucleósidos trifosfato, tampón adecuado para la extensión de los ácidos nucleicos por la polimerasa de ácido nucleico y un conjunto de instrucciones para realizar la amplificación específica de alelo.

13. Un oligonucleótido para realizar una amplificación específica de alelo de una secuencia diana, en el que la 20 amplificación implica la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , dicha secuencia diana existe en forma de varias variantes de secuencias, el oligonucleótido comprende

(a) una secuencia al menos parcialmente complementaria sobre su porción 3' y 5' a una porción de dicha secuencia diana; 25

(b) al menos un nucleótido selectivo complementario a sólo una variante de la secuencia diana, en el que dicho nucleótido selectivo se coloca internamente del extremo 3', y en el que dicho oligonucleótido comprende al menos un nucleótido con una base covalentemente modificada en el grupo amino exocíclico, en el que las estructuras de un nucleótido con una base covalentemente modificada en el grupo amino exocíclico se selecciona del grupo que consiste en: 30

en el que S representa una porción de azúcar, y R representa un grupo modificador, en el que dicho nucleótido modificado aparece en las posiciones -5, -4, -3, -2 o -1 en relación con el extremo 3’. 35

14. El oligonucleótido de la reivindicación 13, en el que dicha base covalentemente modificada en el grupo amino exocíclico comprende un modificador de la siguiente fórmula:

en el que R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alcoxi, arilo y fenoxi sustituidos o sin sustituir.

15. El oligonucleótido de la reivindicación 13, en donde dicha base, covalentemente modificada en el grupo amino 45 exocíclico se selecciona de un grupo que consiste de N6-bencil-adenina, N6-para-terc-butil-bencil adenina, N2-alquil-guanina y N4-bencilcitosina.

16. El oligonucleótido de la reivindicación 13, con una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en Id. de Sec. nº : 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 y 17. 50

17. Una mezcla de reacción para la amplificación específica de alelo de una secuencia diana, en el que la amplificación implica la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , dicha secuencia diana existe en forma de varias variantes de secuencia, la mezcla comprende:

(a) un primer oligonucleótido al menos parcialmente complementario a la secuencia diana; 5

(b) un segundo oligonucleótido al menos parcialmente complementario sobre su porción 3' y 5' a la secuencia diana que tiene al menos un nucleótido complementario selectivo de a solo una variante de la secuencia diana, en el que dicho nucleótido selectivo se coloca internamente del extremo 3', y en donde dicho segundo oligonucleótido comprende al menos un nucleótido con una base covalentemente modificada en el grupo amino exocíclico, en el que el grupo amino exocíclico es el grupo amino en la posición 6 de la adenosina, en la posición 2 de la guanosina o en 10 la posición 4 de la citidina; y una polimerasa de ácido nucleico, nucleósidos trifosfato y un tampón adecuado para la extensión de los ácidos nucleicos por la polimerasa de ácido nucleico.