Alelos mutados del gen zwf (G6PDH) de bacterias corineformes para aumentar la producción de lisina.

Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen,

que codifica un polipéptido con la actividadde la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, caracterizado porque el polipéptido abarca una secuencia de aminoácidosde acuerdo con la SEQ ID NO: 2, en la que en la posición 321 está contenida la L-serina.

Alelos mutados del gen zwf (G6PDH) de bacterias corineformes para aumentar la producción de lisina Son objeto del invento unos mutantes y alelos del gen zwf de bacterias corineformes que codifican unas variantes de la subunidad Zwf de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (EC: 1.1.1.49) y unos procedimientos para la preparación de aminoácidos, en particular L-lisina y L-triptófano mediando utilización de unas bacterias, que contienen estos alelos.

Estado de la técnica

Los aminoácidos encuentran uso en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy especialmente en la nutrición de animales.

Es conocido que ciertos aminoácidos se producen mediante fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular de Cor y nebacterium glutamicum. A causa de la gran importancia, se está trabajando constantemente en el mejoramiento de los procedimientos de producción. Ciertos mejoramientos de los procedimientos pueden concernir a medidas técnicas de fermentación, tales como p.ej. las de agitación y abastecimiento con oxígeno, o a la composición de los medios nutritivos, tal como p.ej. la concentración de azúcares durante la fermentación, o al tratamiento para dar la forma del producto, mediante p.ej. una cromatografía con intercambio de iones, o a las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.

Para el mejoramiento de las propiedades de rendimiento de estos microorganismos se usan unos métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. De esta manera, se obtienen unas cepas, que son resistentes frente a los antimetabolitos o que son auxótrofas para unos metabolitos importantes en regulación y que producen aminoácidos. Un antimetabolito conocido es el compuesto análogo a lisina S- (2-aminoetil) -L-cisteína (AEC) .

Desde hace algunos años se emplean asimismo unos métodos de la técnica del ADN recombinante para el mejoramiento de las cepas de Cor y nebacterium productoras de L-aminoácidos, mediante el recurso de que se amplifican unos genes individuales para la biosíntesis de aminoácidos, y se investiga la repercusión sobre la producción de aminoácidos. Una exposición recopilativa sobre diversos aspectos de la genética, del metabolismo y la biotecnología de Cor y nebacterium glutamicum se pueden encontrar en la cita de Pühler (coordinador jefe de edición) en el Journal of Biotechnology 104 (1-3) , 1-338, 2003.

La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Cor y nebacterium glutamicum está a disposición de un modo general, entre otros lugares, en el banco de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Librar y of Medicin (Bethesda, MD, EE.UU.) . Ella se puede deducir además del documento de solicitud de patente internacional WO 01/00844 como la secuencia n° 243 (= AX065117) .

En el documento WO 01/70995 se describe un mejoramiento de la producción por fermentación de L-aminoácidos por bacterias corineformes mediante el reforzamiento del gen zwf.

En los documentos WO 01/98472 y WO 03/042389 y en el documento de solicitud de patente de los EE.UU. US 2003/0175911 A1 se informa sobre nuevas mutaciones en el gen zwf.

Moritz y colaboradores (European Journal of Biochemistr y 267, 3442-3452 (2000) ) informan sobre unas investigaciones fisiológicas y bioquímicas en la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Cor y nebacterium glutamicum. De acuerdo con unas investigaciones de Moritz y colaboradores, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se compone de una subunidad Zwf y de una subunidad OpcA.

La biosíntesis microbiana de L-aminoácidos en bacterias corineformes es un sistema complejo y está entrelazada en múltiples aspectos con otras diversas rutas de metabolismo en la célula. Por lo tanto, no se puede realizar ninguna predicción sobre cual es la mutación que modifica la actividad catalítica de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de tal manera que se mejore la producción de L-aminoácidos. Por lo tanto, es deseable tener a disposición otras variantes de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

Para obtener el mejor carácter sinóptico, la secuencia de nucleótidos del gen zwf (gen de tipo silvestre) que codifica la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o respectivamente la subunidad Zwf de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Cor y nebacterium glutamicum, se representa de acuerdo con los datos del banco de datos del NCBI en la SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa codificada, que se establece a partir de ésta, se representa en las SEQ ID NO: 2 y 4. En la SEQ ID NO: 3 se indican adicionalmente unas secuencias de nucleótidos, que están situadas corriente arriba (en inglés "upstream") y corriente abajo (en inglés "downstream") .

Misión del invento Los autores del invento se han planteado la misión de poner a disposición unas nuevas medidas técnicas para realizar una mejorada producción de aminoácidos, en particular de L-lisina y L-triptófano.

Descripción del invento Son objeto del invento unos mutantes de bacterias corineformes, producidos o respectivamente aislados, que segregan de manera preferente ciertos aminoácidos, y que contienen un gen o respectivamente un alelo, que codifica un polipéptido con actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, caracterizado porque el polipéptido abarca una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:2, en la que en la posición 321 está contenida la L-serina.

El polipéptido, que está contenido en los mutantes conformes al invento, puede ser designado asimismo como polipéptido Zwf o como subunidad Zwf de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

En el caso de las bacterias corineformes, se prefiere el género Cor y nebacterium. Se prefieren especialmente unas cepas que segregan aminoácidos, que se basan en las siguientes especies:

Cor y nebacterium efficiens, tal como por ejemplo la cepa DSM44549,

Cor y nebacterium glutamicum, tal como por ejemplo la cepa ATCC13032,

Cor y nebacterium thermoaminogenes tal como por ejemplo la cepa FERM BP-1539, y

Cor y nebacterium ammoniagenes, tal como por ejemplo la cepa ATCC6871,

prefiriéndose muy especialmente la especie Cor y nebacterium glutamicum.

Algunos representantes de la especie Cor y nebacterium glutamicum son conocidos a partir del estado de la técnica también bajo otras denominaciones de especies. A éstas pertenecen, por ejemplo:

Cor y nebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Cor y nebacterium lilium DSM20137, Cor y nebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, y Brevibacteritium divaricatum ATCC14020.

Unos representantes conocidos de cepas de bacterias corineformes, que segregan aminoácidos, son, por ejemplo, las cepas que producen L-lisina Cor y nebacterium glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) descrita en el documento de patente europea EP 0 358 940, Cor y nebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) descrita en la cita de Menkel y colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 55 (3) , 684-688 (1989) ) , Cor y nebacterium glutamicum AHP-3 (= Ferm BP-7382) ) descrita en el documento EP 1 108 790, Cor y nebacterium glutamicum NRRL B-11474 descrita en el documento de patente de los EE.UU. US 4.275.157, Cor y nebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP-3304) descrita en el documento US 5.250.423,

o las cepas que producen L-triptófano Cor y nebacterium glutamicum K76 (= Ferm BP-1847) descrita en el documento US 5.563.052, Cor y nebacterium glutamicum BPS13 (= Ferm BP-1777) descrita en el documento US 5.605.818, y Cor y nebacterium glutamicum Ferm BP-3055, descrita en el documento US 5.235.940.

Se encuentran datos acerca de la clasificación taxonómica de ciertas cepas de este conjunto de bacterias, entre otros lugares, en las citas de Seiler (Journal of General Microbiology, 129, 1433-1477 (1983) ) , de Kämpfer y Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996) ) , de Liebl y colaboradores (International Journal of Systematic Bacteriology, 41, 255-260 (1991) ) y en el documento US-A-5.250.434.

Las cepas con la denominación "ATCC" se pueden adquirir de la American Type Culture Collection (Colección americana de cultivos tipos) (Manassas, VA, EE.UU.) . Las cepas con la denominación "DSM" se pueden adquirir de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares) (DSMZ, Braunschweig, Alemania) . Las cepas con la denominación "NRRL" se pueden adquirir de la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (Colección de cultivos de patentes del Servicio para la Investigación Agrícola)... [Seguir leyendo]

1. Mutantes aislados de bacterias corineformes, que contienen un gen, que codifica un polipéptido con la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, caracterizado porque el polipéptido abarca una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, en la que en la posición 321 está contenida la L-serina.

2. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizados porque en el caso de las bacterias corineformes se trata de una bacteria escogida entre el conjunto que se compone de Cor y nebacterium efficiens, Cor y nebacterium glutamicum, Cor y nebacterium thermoaminogenes y Cor y nebacterium aminogenes.

3. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizados porque se trata de Cor y nebacterium glutamicum.

4. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizados porque se trata de unas bacterias que segregan un L-aminoácido.

5. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizados porque se trata de unas bacterias que segregan la L-lisina o el L-triptófano.

6. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizados porque el aminoácido L-serina se intercambia en la posición 8 por otro aminoácido proteinógeno.

7. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizados porque la proteína codificada abarca una secuencia de aminoácidos que se escoge entre el conjunto que se compone de

a) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10, b) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10 inclusive una o como máximo 5 inserción/inserciones o supresión/supresiones de aminoácidos, diferenciándose la actividad enzimática como máximo en un 5% de la actividad del polipéptido con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:6, 8 o 10, y estando contenida la L-serina en la posición correspondiente a la posición 321.

8. Mutantes de bacterias corineformes de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizados porque el gen abarca la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9.

9. Mutantes de bacterias corineformes, caracterizados porque éstos son obtenibles mediante las siguientes etapas:

a) tratamiento de una bacteria corineforme, que posee la capacidad de segregar aminoácidos, con un agente mutágeno, b) aislamiento y multiplicación del mutante producido en a) , c) puesta a disposición de un ácido nucleico procedente del mutante obtenido en b) , d) producción de una molécula de ácido nucleico mediando utilización de la reacción en cadena de la polimerasa, del ácido nucleico procedente de c) , y de un par de cebadores, que se compone de un primer cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos escogidos a partir de la secuencia de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 1 y 1.267 de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO:11, y de un segundo cebador, que comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos, escogidos a partir de la secuencia complementaria de nucleótidos que se encuentra entre las posiciones 2.100 y 1.271 de la SEQ ID NO: 3 o 11, e) determinación de la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico obtenida en d) , y determinación de la secuencia de aminoácidos codificada, f) eventualmente comparación de la secuencia de aminoácidos determinada en f) con la SEQ ID NO: 6, 8 o 10, y g) identificación de un mutante, que contiene un polinucleótido, que codifica un polipéptido con la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que contiene la L-serina en la posición correspondiente a la posición 321 de la SEQ ID NO:2.

10. Un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO:2 con la actividad enzimática de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que contiene la L-serina en la posición 321 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2.

11. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque la proteína codificada contiene una secuencia de aminoácidos que se escoge entre el conjunto que se compone de

a) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10, b) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10 inclusive una o como máximo 5 inserción/inserciones de aminoácidos, diferenciándose la actividad enzimática como máximo en un 5 % de la actividad del polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6, 8 o 10, y estando contenida la L-serina en la posición correspondiente a la posición 321.

12. Polinucleótido aislado de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque el polipéptido codificado abarca la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10.

13. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos abarca la SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9.

14. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos abarca la SEQ ID NO:11.

15. Un fragmento aislado de un polinucleótido, que abarca una molécula de ácido nucleico, que codifica por lo menos un marco de lectura con una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 307 hasta 335 de la SEQ ID NO:2, estando contenida la L-serina en la posición 321 de la SEQ ID NO:2.

16. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque codifica un marco de lectura con una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 307 hasta 335 de la SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:10.

17. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos contiene uno o varios intercambio (s) conservativo (s) de aminoácidos, no concerniendo a la posición 321 los intercambios conservativos de aminoácidos.

18. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque contiene una o varias mutación/mutaciones muda (s) .

19. Polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque abarca por lo menos una secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 919 hasta 1.005 de la SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:9.

20. Procedimiento para la producción de una bacteria corineforme recombinante, caracterizado porque

a) se transfiere un polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 10 hasta 14 o de acuerdo con las reivindicaciones 14 hasta 19 a una bacteria corineforme b) el gen de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa presente en el cromosoma de la bacteria corineforme, que codifica una secuencia de aminoácidos con glicina en la posición 321 y eventualmente con L-serina en la posición 8 o en una posición comparable de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, se intercambia por el polinucleótido procedente de a) , y c) se multiplica la bacteria corineforme obtenida de acuerdo con las etapas a) y b) .

21. Procedimiento para la producción de un microorganismo recombinante, caracterizado porque

a) se transfiere un polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 10 hasta 14 a un microorganismo, b) el polinucleótido aislado se replica en el microorganismo, y c) se multiplica el microorganismo obtenido de acuerdo con las etapas a) y b) .

22. Un microorganismo recombinante, que contiene el polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 10 hasta 14 o 15 hasta 19.

23. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado porque se trata de una bacteria corineforme o de una bacteria del género Escherichia.

24. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizado porque en el caso de la bacteria corineforme se trata del género Cor y nebacterium.

25. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado porque en el caso de la bacteria del género Cor y nebacterium se trata de la especie Cor y nebacterium glutamicum.

26. Un vector, que contiene el polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 10 hasta 14 o 15 hasta 19.

27. Un microorganismo recombinante, que contiene el vector de acuerdo con la reivindicación 26.

28. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizado porque se trata de una bacteria corineforme o de una bacteria del género Escherichia.

29. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizado porque en el caso de la bacteria corineforme se trata del género Cor y nebacterium.

30. Microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque en el caso de la bacteria del género Cor y nebacterium se trata de la especie Cor y nebacterium glutamicum.

31. Procedimiento para la producción de un L-aminoácido, caracterizado porque

a) se fermenta una bacteria corineforme aislada en un medio adecuado, conteniendo la bacteria por lo menos una copia de un gen que codifica un polipéptido con la actividad enzimática de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, estando definidas las secuencias de aminoácidos del polipéptido en las reivindicaciones 1, 6 y 7. y b) el L-aminoácido se enriquece en el caldo de fermentación o en las células de la bacteria.

32. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31, caracterizado porque en el caso de la bacteria corineforme aislada se trata de un mutante de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 9.

33. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31, caracterizado porque en el caso de la bacteria corineforme aislada se trata de una bacteria corineforme recombinante, que contiene un polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 10 hasta 21 o que se había producido mediando utilización del mismo.

34. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31, caracterizado porque se aísla o recoge el L-aminoácido.

35. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 34, caracterizado porque se purifica el L-aminoácido.

36. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31, caracterizado porque el L-aminoácido se aísla o se recoge en común con unos componentes procedentes del caldo de fermentación y/o de la biomasa (> 0 hasta 100 %) .

37. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31, caracterizado porque

a) la biomasa formada se elimina en una proporción de 0 a 100 % a partir del caldo de fermentación obtenido a partir de la etapa b) de la reivindicación 34, y b) a partir del caldo obtenido en la etapa a) se produce un producto que está esencialmente seco y conformado, mediante un método escogido entre el conjunto que se compone de una granulación, una compactación, una desecación por atomización y una extrusión.

38. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 37, caracterizado porque a un caldo de fermentación que contiene L-lisina, antes o después de la etapa a) se le añade un ácido escogido entre el conjunto que se compone de ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y ácido fosfórico.

39. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 37, caracterizado porque a partir del caldo obtenido antes o después de la etapa a) , se elimina el agua.

40. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 37, caracterizado porque el producto conformado obtenido en o durante la etapa b) es rociado con un aceite.