Aislamiento de ácido nucleico.

Procedimiento para aislar un ácido nucleico, que comprende:

(i) unir el ácido nucleico a una fase sólida a un primer pH en presencia de un tampón de unión,

en el que el primer pH es un pH ácido;

(ii) lavar el ácido nucleico unido con una solución de lavado; y

(iii) eluir el ácido nucleico de la fase sólida a un segundo pH que es más elevado que el primer pH, en el que el segundo pH está en el intervalo de 6,5-10;

en el que la solución de lavado comprende un tampón con un intervalo de tamponamiento que comprende un pH que es más elevado que el primer pH, y la solución de lavado está a un pH que está dentro de un intervalo de tamponamiento del tampón de unión, pero inferior al intervalo de tamponamiento del tampón de la solución de lavado, y en el que el pH de la solución de lavado es pH 6,0 o inferior.

Aislamiento de ïcido nucleico [0001] La presente invenciïn se refiere a procedimientos mejorados para el aislamiento de ïcido nucleico, y a las soluciones, composiciones y kits para utilizar en los procedimientos.

Los procedimientos convencionales para el aislamiento de ïcido nucleico utilizan agentes caotrïpicos, tales como tiocianato de guanidinio, y disolventes orgïnicos para lisar las cïlulas, y desnaturalizar las proteïnas (incluyendo nucleasas, que de otro modo degradan el ïcido nucleico) . Por ejemplo, Boom et al. (Journal of Clinical Microbiology, 1990, vol. 28 (3) : 495-503) describe un procedimientos en el que se pone en contacto una muestra que contiene suero u orina humana con partïculas de sïlice en presencia de un tampïn de lisis/uniïn que contiene tiocianato de guanidinio. El ïcido nucleico liberado se une a las partïculas de sïlice, que a continuaciïn se lavan con un tampïn de lavado que contiene tiocianato de guanidinio, a continuaciïn con etanol, y despuïs con acetona. El ïcido nucleico unido se eluye posteriormente en un tampïn acuoso bajo en sal (Tris-HCl, EDTA, pH 8, 0) .

Sin embargo, una desventaja de dichos procedimientos es que los agentes caotrïpicos y disolventes orgïnicos son muy inhibidores en las reacciones enzimïticas. Las cantidades residuales de estas sustancias transportadas en la muestra eluida pueden interferir con el posterior procesamiento enzimïtico del ïcido nucleico aislado, por ejemplo en la secuenciaciïn o amplificaciïn de ïcido nucleico. El uso de agentes caotrïpicos y disolventes orgïnicos tambiïn es indeseable debido a que estos reactivos son tïxicos y difïciles de manipular, y requieren una disposiciïn especial para su eliminaciïn. Una desventaja adicional del uso de agentes caotrïpicos es que requieren molaridades elevadas y tienden a precipitar fuera de la soluciïn durante el almacenamiento, especialmente el almacenamiento refrigerado. Las soluciones que contienen estos agentes pueden requerir un calentamiento para volver a disolver el agente caotrïpico antes de su uso.

El requisito para las sales caotrïpicas y los disolventes orgïnicos se evita en un procedimiento descrito por Hourfar et al, (Clinical Chemistr y , 2005, 51 (7) : 1217-1222) . La muestra de plasma se mezcla con partïculas de sïlice magnïticas en presencia de un tampïn de uniïn/lisis que contiene una sal cosmotrïpica (sulfato de amonio) antes de la adiciïn de proteinasa K. Despuïs de la separaciïn, las partïculas magnïticas se lavan con tampïn de lavado que contiene proteinasa K, y se eluyen en tampïn de eluciïn (Tris-HCl, pH 8, 5) a 80ïC Mientras que el ïcido nucleico se puede obtener en rendimientos razonables utilizando dichos procedimientos, se desea obtener un rendimiento incluso mayor rendimiento de ïcido nucleico. Tambiïn se desea proporcionar procedimientos que se pueden llevar a cabo sin ningïn requisito para las enzimas, tales como proteinasa K. El uso de enzimas aumenta el coste de llevar a cabo los procedimientos, y es necesario almacenar las enzimas por separado en condiciones especiales (por ejemplo, a temperatura reducida, o en forma liofilizada) para mantener su estabilidad.

El documento WO 2004/055207 describe procedimientos para aislar ïcidos nucleicos de muestras biolïgicas utilizando un material de soporte inorgïnico. La uniïn de los ïcidos nucleicos al material de soporte tiene lugar en condiciones ïcidas y la eluciïn tiene lugar en condiciones bïsicas. En los ejemplos 1 y 2 de este documento, el tampïn de uniïn utilizado es Tris acetato 200 mM pH 4, 0, NP40 al 0, 5%, sulfato de amonio 200 mM, el tampïn de lavado es Tris-HCl 10 mM pH 6, 6, y el tampïn de eluciïn es Tris/HCl 10 mM pH 8, 5.

El documento WO 99/23111 describe un proceso para la producciïn de componentes de alta seguridad viral para formar un enganche de fibrina a partir de una recogida de plasma humano. El precipitado formado durante el procedimiento se lava con una soluciïn de Tris-HCl al 0, 1 % de pH 4, 5-5, 0 o a pH 9, 50-10, 50 producida en agua pura.

Segïn la presente invenciïn, se proporciona un procedimiento para aislar un ïcido nucleico, que comprende:

(i) unir el ïcido nucleico a una fase sïlida a un primer pH en presencia de un tampïn de uniïn, en el que el primer pH es un pH ïcido;

(ii) lavar el ïcido nucleico unido con una soluciïn de lavado; y

(iii) eluir el ïcido nucleico de la fase sïlida a un segundo pH que es mïs elevado que el primer pH, en el que el segundo pH estï en el intervalo de 6, 5-10; en el que la soluciïn de lavado comprende un tampïn con un intervalo de tamponamiento que comprende un pH que es mïs elevado que el primer pH, y la soluciïn de lavado estï a un pH que estï dentro de un intervalo de tamponamiento del tampïn de uniïn, pero inferior al intervalo de tamponamiento del tampïn de la soluciïn de lavado (es decir, el tampïn de lavado) y en el que el pH de la soluciïn de lavado es pH 6, 0 o inferior.

Se ha encontrado que los procedimientos de la presente invenciïn proporcionan sorprendentes aumentos en el rendimiento de ïcido nucleico obtenido en comparaciïn con los procedimientos de la tïcnica anterior, por ejemplo el procedimiento descrito por Hourfar et al. Se cree que el rendimiento mejorado obtenido usando procedimientos de la presente invenciïn es debido a que se eliminan cantidades reducidas de ïcido nucleico de la fase sïlida durante la etapa de lavado, y/o se liberan cantidades incrementadas de ïcido nucleico de la fase sïlida durante la etapa de eluciïn, en comparaciïn con los procedimientos de la tïcnica anterior.

La mejora de los rendimientos de ïcido nucleico pueden obtenerse utilizando los procedimientos de la presente invenciïn sin ningïn requisito para la enzima (tal como, proteasa) de que estï presente en la soluciïn de lavado, o para el uso de disolventes orgïnicos o agentes caotrïpicos. La soluciïn de lavado se simplifica de esta manera en comparaciïn, por ejemplo, con la soluciïn de lavado requerida para el procedimiento de Hourfar et al., y no hay ningïn requisito para el almacenamiento separado de la proteasa u otra enzima. Debido a que no hay ningïn requisito para agentes caotrïpicos o disolventes orgïnicos, puede evitarse la inhibiciïn del posterior procesamiento enzimïtico del ïcido nucleico aislado por tales agentes o disolventes.

Preferiblemente, el primer pH estï en el intervalo de pH 3-6 o pH 3-5. Preferiblemente, el segundo pH es por lo menos pH 7, 0 o un pH alcalino. De manera adecuada, el segundo pH estï en el intervalo de pH 7-9. Dichos valores de pH son habituales de los que se utilizan con fases sïlidas, tales como fases sïlidas a base de sïlice que son capaces de unirse a ïcido nucleico a un pH mïs bajo y liberar el ïcido nucleico a un pH mïs elevado. Los extremos de pH se evitan ya que de otro modo podrïan daïar el ïcido nucleico.

Preferiblemente, el intervalo de tamponamiento del tampïn de lavado es mïs elevado que el primer pH (es decir, un extremo inferior del intervalo de tamponamiento del tampïn de lavado es superior que el primer pH) . Preferiblemente, el intervalo de tamponamiento del tampïn de lavado es mïs elevado que pH 5, 0. Preferiblemente, el segundo pH estï dentro del intervalo de tamponamiento del tampïn de lavado. Esto se prefiere porque se cree que el pH de la soluciïn de lavado residual presente en la fase sïlida despuïs de la etapa de lavado se puede convertir a continuaciïn de manera mïs eficiente al segundo pH durante la etapa de eluciïn maximizando de ese modo la cantidad de ïcido nucleico que se libera de la fase sïlida.

Preferiblemente, el pH de la soluciïn de lavado es de pH 6, 3 a 6, 0. El uso de soluciïn de lavado a un pH dentro de este intervalo preferido es compatible con intervalos de tamponamiento de los tampones de uniïn y de lavado preferidos.

Preferiblemente, el primer pH estï dentro del intervalo de tamponamiento del tampïn de uniïn de manera que el pH de la etapa de uniïn se controla mediante el tampïn de uniïn. Preferiblemente, un extremo inferior del intervalo de tamponamiento del tampïn de uniïn es a un pH de 3, 0 o superior, de manera que se evitan los extremos de pH en la etapa de uniïn.

Los intervalos de tamponamiento de tampones utilizados habitualmente en los tampones de lisis, uniïn, lavado, y eluciïn son conocidos por los expertos en la materia. En la tabla 1 siguiente se proporciona el valor de pKa y el intervalo de tamponamiento de algunos tampones biolïgicos importantes, ordenados por el intervalo de tamponamiento (tomado de Sigma-Aldrich) .

Tabla 1

Intervalo de pH eficaz pKa 25ïC Tampïn

1, 2-2, 6 1, 97 maleato (pK1)

1, 7-2, 9 2, 15 fosfato (pK1)

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1. Procedimiento para aislar un ïcido nucleico, que comprende:

(i) unir el ïcido nucleico a una fase sïlida a un primer pH en presencia de un tampïn de uniïn, en el que el primer pH es un pH ïcido;

(ii) lavar el ïcido nucleico unido con una soluciïn de lavado; y

(iii) eluir el ïcido nucleico de la fase sïlida a un segundo pH que es mïs elevado que el primer pH, en el que el segundo pH estï en el intervalo de 6, 5-10; en el que la soluciïn de lavado comprende un tampïn con un intervalo de tamponamiento que comprende un pH que es mïs elevado que el primer pH, y la soluciïn de lavado estï a un pH que estï dentro de un intervalo de tamponamiento del tampïn de uniïn, pero inferior al intervalo de tamponamiento del tampïn de la soluciïn de lavado, y en el que el pH de la soluciïn de lavado es pH 6, 0 o inferior.

2. Procedimiento, segïn la reivindicaciïn 1, en el que el intervalo de tamponamiento del tampïn de lavado es mïs elevado que el primer pH, preferiblemente mïs elevado que pH 5, 0.

3. Procedimiento, segïn la reivindicaciïn 1 ï 2, en el que el segundo pH estï dentro del intervalo de tamponamiento del tampïn de lavado, preferiblemente en el intervalo de pH 7-9.

4. Procedimiento, segïn cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que el pH de la soluciïn de lavado es desde pH 3, 0 a pH 6, 0.

5. Procedimiento, segïn cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que el primer pH estï dentro del intervalo de tamponamiento del tampïn de uniïn, preferiblemente en el intervalo de pH 3-6, o pH 3-5.

6. Procedimiento, segïn cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que el extremo inferior del intervalo de tamponamiento del tampïn de uniïn es a pH 3, 0 o mïs elevado.

7. Procedimiento, segïn cualquiera de las realizaciones anteriores, que se lleva a cabo en ausencia de un agente caotrïpico y un disolvente orgïnico.

8. Procedimiento, segïn cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la uniïn del ïcido nucleico a la fase sïlida se lleva a cabo en presencia de un agente cosmotrïpico, preferiblemente sulfato de amonio.

9. Procedimiento, segïn cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la fase sïlida comprende un grupo ionizable negativamente con un pKa entre el primer y el segundo pH o en el que la fase sïlida comprende un ïxido inorgïnico, preferiblemente sïlice.

10. Procedimiento para aislar un ïcido nucleico de una cïlula, que comprende lisar la cïlula para liberar el ïcido nucleico de la cïlula, y aislar el ïcido nucleico liberado utilizando el procedimiento, segïn cualquiera de las realizaciones anteriores.

11. Procedimiento, segïn la reivindicaciïn 10, en el que la lisis se lleva a cabo utilizando el tampïn de uniïn, que comprende preferiblemente un agente cosmotrïpico.

12. Procedimiento, segïn cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que el ïcido nucleico se eluye de la fase sïlida a una temperatura por encima de la temperatura ambiente.

13. Procedimiento, segïn cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que el ïcido nucleico se eluye de la fase sïlida en presencia de un tampïn de eluciïn, en el que el segundo pH estï dentro de un intervalo de tamponamiento del tampïn de eluciïn, y preferiblemente el intervalo de tamponamiento del tampïn de eluciïn se solapa con el intervalo de tamponamiento del tampïn de lavado o estï comprendido por el mismo.

14. Kit para el aislamiento de un ïcido nucleico, que comprende: i) un tampïn de uniïn para unir el ïcido nucleico a una fase sïlida a un primer pH, en el que el primer pH es un pH ïcido; y ii) a) una soluciïn de lavado que comprende un tampïn con un intervalo de tamponamiento que comprende un pH que es mïs elevado que el primer pH, en el que la soluciïn de lavado estï a un pH que estï dentro de un intervalo de tamponamiento del tampïn de uniïn, pero inferior al intervalo de tamponamiento del tampïn de lavado, y en el que el pH de la soluciïn de lavado es pH 6, 0 o inferior; y opcionalmente b) una soluciïn para eluir el ïcido nucleico de la fase sïlida, en el que la soluciïn estï a un segundo pH que es mïs elevado que el primer pH, y en el que el segundo pH estï en el intervalo de pH 6, 5-10; o iii) a) una composiciïn en forma seca que cuando se disuelve en un lïquido proporciona una soluciïn de lavado segïn (ii) (a) ;

y opcionalmente b) una composiciïn en forma seca que cuando se disuelve en un lïquido proporciona una soluciïn segïn (ii) (b) .

15. Kit, segïn la reivindicaciïn 14, en el que el intervalo de tamponamiento del tampïn en la soluciïn de lavado o cada uno de ellos es mïs elevado que el pH 6, 0, y preferiblemente se solapa con el intervalo de pH 6, 5-10, estï comprendido por el mismo o lo comprende, o en el que la composiciïn en forma seca que cuando se disuelve en un lïquido proporciona una soluciïn de lavado tal como se define en la reivindicaciïn 14 (ii) (a) , en el que el intervalo de tamponamiento del tampïn en la soluciïn de lavado o cada uno de ellos es mïs elevado que el pH 6, 0, y preferiblemente se solapa con el intervalo de pH 6, 5-10, estï comprendido por el mismo o lo comprende.

16. Kit, segïn la reivindicaciïn 15, en el que el tampïn de lavado comprende un tampïn Tris, preferiblemente Tris-HCl.

17. Kit, segïn la reivindicaciïn 15 ï 16, en el que la soluciïn de lavado no incluye una proteasa y/o comprende 15 ademïs un detergente.

18. Kit, segïn cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que el kit no comprende un agente caotrïpico, y el kit no comprende un disolvente orgïnico y/o el tampïn de uniïn comprende un agente cosmotrïpico.

19. Kit, segïn cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, que comprende ademïs una fase sïlida a la que es capaz de unirse el ïcido nucleico en presencia del tampïn de uniïn al primer pH, y desde la que el ïcido nucleico se puede eluir al segundo pH, en el que la fase sïlida comprende preferiblemente un grupo ionizable negativamente con un pKa entre un primer pH en el que el ïcido nucleico es capaz de unirse a la fase sïlida y un segundo pH en el que al ïcido nucleico se puede eluir de la fase sïlida, o un ïxido inorgïnico, preferiblemente sïlice.

20. Kit, segïn cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, que comprende ademïs una proteasa, preferiblemente en forma liofilizada, separada del tampïn de uniïn.

21. Utilizaciïn del kit, segïn cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, para el aislamiento de un ïcido nucleico. 30