Ácidos nucleicos y polipéptidos de lisavirus quiméricos.

Composición inmunógena que comprende un polipéptido quimérico codificado por una molécula portadora quecontiene una secuencia polinucleotídica,

en la que dicha secuencia polinucleotídica comprende:

- una secuencia que codifica una parte de una glicoproteína de lisavirus que contiene por lo menos el sitio IIIde la glicoproteína, y

- una secuencia que codifica por lo menos una secuencia antigénica diferente al sitio III o sitio II de laglicoproteína de lisavirus seleccionada de entre el grupo constituido por secuencias de proteína antigénica, osu parte antigénica, a partir de otro virus de la rabia o virus relacionado con la rabia.

Ácidos nucleicos y polipéptidos de lisavirus quiméricos.

La presente divulgación se refiere a ácidos nucleicos de lisavirus quiméricos, y polipéptidos y proteínas quiméricos codificados por estos ácidos nucleicos. Más particularmente, la divulgación se refiere a ácidos nucleicos y proteínas de lisavirus quiméricos que pueden ser utilizados en composiciones inmunógenas, tales como vacunas. Por lo tanto, la invención se refiere asimismo a moléculas portadoras para expresar los ácidos nucleicos de lisavirus quiméricos, procedimientos para producir proteínas y polipéptidos de lisavirus quiméricos, y procedimientos para tratar individuos para mejorar, curar o proteger contra la infección por lisavirus.

La rabia es una enfermedad encefalopática provocada por elementos del género Lyssavirus dentro de la familia Rhabdoviridae. La rabia infecta a todos los animales de sangre caliente e invariablemente es casi mortal en seres humanos si no son tratados. Con base a las comparaciones de secuencias nucleotídicas y análisis filogenéticos, el género de Lyssavirus se ha dividido en 7 genotipos (GT) . GT1 incluye las cepas clásicas de vacuna y virus de rabia, mientras que GT2 a GT7 corresponden a virus relacionados con rabia que incluyen virus de murciélago de Lagos (GT2) ; virus de Mokola (GT3) ; virus de Duvenhage (GT4) ; lisavirus de murciélago europeo 1 (EBL-1: GT5) ; lisavirus de murciélago europeo 2 (EBL-2: GT6) ; y lisavirus de murciélago australiano (GT7) .

En base en la antigenicidad, el género Lyssavirus se dividió primero en cuatro serotipos. Más recientemente, este género se dividió en dos grupos principales de acuerdo con la reactividad cruzada del anticuerpo neutralizante del virus (VNAb) : El grupo 1 consiste en GT1, GT4, GT5, GT6, y GT7, mientras que el grupo 2 consiste en GT2 y GT3. Los virus del grupo 2 no son patógenos cuando se inyectan periféricamente en ratones. La virulencia de los lisavirus depende, al lo menos en parte, de la glicoproteína presente en el recubrimiento viral. De manera interesante, las glicoproteínas de los virus del grupo 2 muestran un alto grado de identidad, en la región que contiene aminoácidos que empeñan un papel importante en la patogenicidad, con la secuencia correspondiente de virus GT1 no virulentos (véase, por ejemplo Coulon et al., 1998, “An avirulent mutant of rabies virus is unable to infect motoneurons in vivo and in vitro”, J. Virol. 72:273-278) .

La glicoproteína del virus de rabia (G) está compuesta de un dominio citoplásmico, un dominio transmembranario y un ectodominio. La glicoproteína es un trímero, con los ectodominios expuestos en la superficie del virus. El ectodominio está involucrado en la inducción de tanto la protección como la producción de VNAb después de la vacunación, tanto antes como después de la exposición al virus. Por lo tanto, se ha dado mucha atención a G en el desarrollo de vacunas de subunidad de rabia. De manera estructural, G contiene tres regiones, la región terminal del extremo amino (N-terminal) , una región de “bisagra” o “enlazadora”, y la región terminal del extremo carboxílico (Cterminal) . (Véase figura 1) .

Como se ilustra en la figura 1, generalmente se piensa que el ectodominio de la glicoproteína (G) tiene dos sitios principales antigénicos, el sitio II y el sitio III, los cuales son reconocidos por aproximadamente 72, 5% (sitio II) y 24% (sitio III) de anticuerpos monoclonales neutralizantes (MAb) , respectivamente. El sitio II está localizado en la mitad terminal del extremo N de la proteína, y el sitio III está localizado en la mitad terminal del extremo C de la proteína. Las dos mitades están separadas mediante una bisagra flexible alrededor de la región lineal (aminoácido 253 a 257) .

El ectodominio de G contiene además un sitio menor (sitio a) , y varios epítopos reconocidos por MAbs individuales (I: resto 231 de aminoácidos; V: resto 294, y VI: resto 264) (5, 10, 18, 21 ref. 2) . El sitio II es conformacional y discontinuo (restos 34 a 42 de aminoácidos y restos 198 a 200 de aminoácidos, los cuales están asociados mediante puentes de disulfuro) , mientras que el sitio III es conformacional y continuo (restos 330 a 338) . La lisina 330 y arginina 333 en el sitio III juegan un papel importante en neurovirulencia, y pueden estar implicadas en el reconocimiento de receptores neuronales (véase, por ejemplo, Coulon et al., supra, y Tuffereau et al., 1998, “Neuronal cell surface molecules mediate specific binding to rabies virus glycoprotein expressed by a recombinant baculovirus on the surfaces of lepidopteran cells”, J. Virol. 72:1085-1091) . Los sitios II y III parecen estar próximos entre sí en la estructura tridimensional, y expuestos en la superficie de la proteína (Gaudin, Y., 1997, “Folding of rabies virus glycoprotein: epitope acquisition and interaction with endoplasmic reticulum chaperones”, J. Viro. 71:3742-3750) . Sin embargo, a pH bajo, la molécula de G toma una conformación inactiva de fusión en la cual el sitio II no es accesible para MAbs, mientras que los sitios a y III permanecen más o menos expuestos (Gaudin, Y. Et al., 1995, “Biological function of the low-pH, fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein (G) : G is transported in a fusion-inactive state-like conformation”, J. Virol. 69:5528-5533; Gaudin, Y., et al., 1991, “Reversible conformational changes and fusion activity of rabies virus glycoprotein”, J. Virol. 65:4853-4859) .

Además, varias regiones distribuidas a lo largo del ectodominio están involucradas en la inducción de células auxiliares T (Th) (MacFarlan, R. et al., 1984, “T cell responses to cleaved rabies virus glycoprotein and to synthetic peptides”, J. lmmunol. 133:2748-2752; Wunner, W. et al. 1985, “Localization of immunogenic domains on the rabies virus glycoprotein”, Ann. Inst. Pasteur, 136 E:353-362) . Basándose en estas propiedades estructurales e inmunológicas, se ha sugerido que la molécula de G puede contener dos partes inmunológicamente activas, cada una potencialmente capaz de inducir tanto VNAb como células Th (Bahloul, C. et al., 1998, “DNA-based

immunization for exploring the enlargement of immunological cross-reactivity against the lyssaviruses”, Vaccine 16:417-425) .

Las vacunas actualmente disponibles consisten o derivan principalmente de virus GT1, contra los cuales dan protección. Muchas cepas de vacunas no son efectivas contra GT4, y ninguna es efectiva contra GT2 o GT3. Sin embargo, la protección producida contra GT4 a 6 depende de la cepa de la vacuna. Por ejemplo, la protección de lisavirus de murciélago europeo (GT5 y GT6) , cuyo aislamiento se ha hecho más frecuente en años recientes, mediante la cepa de vacuna de rabia PM (Pitman-Moore) no es muy robusta. La cepa PM induce una protección contra EBL1 (GT5) más débil que la protección que proporciona contra la cepa PV (virus de Pasteur) .

Debido, en parte, a la importancia de la rabia en la salud mundial, existe una continua necesidad de proporcionar vacunas seguras, efectivas, y de acción rápida, y composiciones inmunógenas para tratar y prevenir esta enfermedad. Muchos enfoques distintos del uso de preparaciones de virus intactos se han propuesto y/o perseguido para proporcionar una composición inmunógena efectiva, y rentable específica para virus de rabia. Por ejemplo, como se discutió anteriormente, se han desarrollado vacunas de subunidad. También, se han propuesto vacunas con cierto valor que podrían generar una respuesta inmune a múltiples serotipos de rabia, así como otros diversos patógenos (Comisión Europea COST/STD-3, 1996 “Advantages of combined vaccines” Vaccine 14:693-700) . De hecho, se ha dado a conocer recientemente el uso de una vacuna combinada de difteria, tétanos, tos ferina de células intactas, poliomielitis inactivada, y rabia (Lang J. et al., 1997, “Randomised Feasibility trial of pre-exposure rabies vaccination with DTP-IPV in infants” The Lancet 349:1663-1665) . Las vacunas combinadas que incluyen rabia también se han utilizado para inmunización de perros (virus de moquillo, hepatitis, leptospirosis y parvocanino) , gatos (virus de panleucopenia, calici- y parvo-felino) y ganado (virus de la glosopeda) (Pastoret, P-P. et al., 1997, “Vaccination against rabies” en Veterinar y Vaccinology, Pastoret, P-P. et al., Eds. (Elsevier) : 616-628 23) .

Además, las vacunas producidas en cultivos de tejidos son costosas de producir a pesar de algunos intentos para reducir sus costes. Por consiguiente, las vacunas de ADN, las cuales son menos costosas de producir y ofrecen muchas ventajas, constituirían una alternativa valiosa. Los... [Seguir leyendo]

1. Composición inmunógena que comprende un polipéptido quimérico codificado por una molécula portadora que contiene una secuencia polinucleotídica, en la que dicha secuencia polinucleotídica comprende: 5

- una secuencia que codifica una parte de una glicoproteína de lisavirus que contiene por lo menos el sitio III de la glicoproteína, y

- una secuencia que codifica por lo menos una secuencia antigénica diferente al sitio III o sitio II de la

glicoproteína de lisavirus seleccionada de entre el grupo constituido por secuencias de proteína antigénica, o su parte antigénica, a partir de otro virus de la rabia o virus relacionado con la rabia.

2. Composición inmunógena según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia polinucleotídica contenida en la molécula portadora comprende una secuencia que codifica por lo menos la mitad terminal del extremo C de una 15 glicoproteína de lisavirus que consiste en los aminoácidos 253 a 505 de la glicoproteína de lisavirus.

3. Composición inmunógena según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia polinucleotídica contenida en la molécula portadora comprende además una secuencia que codifica un dominio transmembranario de una proteína transmembranaria.

4. Composición inmunógena según la reivindicación 3, en la que dicho dominio transmembranario es de una glicoproteína de lisavirus.

5. Composición inmunógena según la reivindicación 3, en la que dicho dominio transmembranario es de una 25 proteína diferente a la glicoproteína de lisavirus.

6. Composición inmunógena según las reivindicaciones 3 a 5, en la que dicha secuencia polinucleotídica contenida en la molécula portadora comprende además una secuencia que codifica un dominio citoplásmico de la glicoproteína de dicho lisavirus.

7. Composición inmunógena según la reivindicación 4, en la que dicha secuencia polinucleotídica contenida en la molécula portadora comprende además una secuencia que codifica un dominio citoplásmico de la glicoproteína de un lisavirus, siendo el dominio transmembranario y el dominio citoplásmico del mismo lisavirus.

8. Composición inmunógena según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia polinucleotídica contenida en la molécula portadora comprende:

a) una secuencia que codifica una secuencia de sitio II de una glicoproteína de un lisavirus;

b) una secuencia que codifica una secuencia de sitio III de una glicoproteína de un lisavirus;

c) un dominio transmembranario de una proteína transmembranaria;

d) un dominio citoplásmico de una proteína transmembranaria; y

e) una secuencia que codifica por lo menos una secuencia antigénica diferente al sitio III o sitio II de la glicoproteína de lisavirus seleccionada de entre el grupo constituido por secuencias de proteína antigénica, o su parte antigénica, a partir de otro virus de la rabia o virus relacionado con la rabia.

9. Composición inmunógena según las reivindicaciones 1 a 8 que comprende además un componente seleccionado de entre el grupo constituido por adyuvantes, excipientes, estabilizantes, vectores supramoleculares y antígenos.

10. Composición inmunógena según las reivindicaciones 1 a 9, que es una vacuna.

11. Composición inmunógena según las reivindicaciones 1 a 10, que comprende inmunidad celular y humoral.

12. Procedimiento para la preparación in vivo o in vitro de un polipéptido quimérico comprendido en la composición inmunógena según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque dicho procedimiento comprende las etapas siguientes:

a) producir mediante un procedimiento in vivo o in vitro dicho polipéptido quimérico a partir de una molécula portadora como en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que codifica dicho polipéptido quimérico; y

b) purificar el polipéptido obtenido en la etapa a) . 65

13. Procedimiento para la preparación in vivo de un polipéptido quimérico según la reivindicación 12, en el que en la etapa a) , dicho polipéptido quimérico es producido por la expresión de la molécula portadora en cultivos tisulares o bacterianos y en la etapa b) , el polipéptido quimérico obtenido es aislado de estos cultivos.

14. Procedimiento para la preparación in vivo o in vitro de un polipéptido quimérico según la reivindicación 12 o 13, que comprende además una etapa c) que consiste en combinar el polipéptido quimérico con componentes seleccionados de entre el grupo constituido por compuestos o aditivos que pueden mejorar la inmunogenicidad, la estabilidad y la biodisponibilidad de la composición inmunógena.