ÁCIDOS NUCLEICOS ÚTILES PARA DESENCADENAR LA MORTALIDAD DE CÉLULAS TUMORALES.

- Uso de una molécula de ácido nucleico que comprende una parte de doble cadena de 24- 100 bp,

que tiene al menos un extremo libre y que es sustrato de unión por al menos una proteína Ku involucrada en la vía NHEJ de reparación de roturas de dobles cadenas, para fabricar un medicamento para intensificar la sensibilidad tumoral a terapia anticancerosa que daña el DNA

Esta invención se encuentra, en general, en el campo del uso de fragmentos de oligonucleótidos/DNA para aplicaciones biológicas y terapéuticas, y más específicamente, en el campo de los ácidos nucleicos que interfieren con las vías de indicación y reparación de daños del DNA, en particular la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) de reparación de roturas de las dobles 5 cadenas (DSB).

La invención se refiere a ácidos nucleicos, útiles como herramientas para desencadenar la mortalidad celular de tumores sometidos a terapias anticancerosas.

La radioterapia. la quimioterapia, solas o combinadas con cirugía, son arsenales terapéuticos esenciales contra el cáncer humano. 10

Las radiaciones ionizantes ocasionan directa o indirectamente roturas de las dobles cadenas del DNA (DSBs) y desencadenan la muerte de células /tejidos (necrosis o apoptosis). El efecto citotóxico de la radiación ionizante forma la base de la terapia de radiación, ampliamente utilizada en el tratamiento de cánceres humanos. La eficacia de la radioterapia está limitada actualmente por la resistencia a la radiación de ciertos tumores (por ejemplo, glioblastomas), y por los efectos secundarios causados por 15 irradiación de los tejidos normales próximos (por ejemplo, en el tratamiento del cáncer de mama y del cáncer cervical).

En los años pasados, muchos estudios se han enfocado sobre mecanismos biológicos relacionados con la respuesta a la radiación ionizante, con objeto de conseguir una nueva percepción de la complejidad de los fenómenos que subyacen en la radiosensibilidad o en la radiorresistencia de las 20 células tumorales. El entendimiento de las diferentes vías que regulan finalmente la respuesta a la radiación ionizante, constituye una fase importante conducente a la identificación de dianas moleculares para nuevos fármacos y nuevos tratamientos terapéuticos que, en asociación con la radioterapia, podrían mejorar la oportunidad de mejoría de tumores resistentes a la radiación, tales como tumores cerebrales o de cabeza y de cuello. 25

El empleo de agentes quimioterápicos puede ocasionar daños del DNA, con inclusión de DSBs, directos o indirectos. Son ejemplos de la mayoría de las familias de agentes quimioterápicos empleados (agentes citotóxicos químicos) los inhibidores de las topoisomerasas I ó II (camptotecina/topotecán, epirubicina/etóposido), agentes de entrecruzamiento del DNA (cisplatino/carbo-

platino/oxaliplatino), agentes de alquilación del DNA (carmustina/dacarbacina), o agentes antimetabólicos 30 (5-fluorouracilo/gemcitabina/capecitabina), así como inhibidores de husos mitóticos (paclitahel/docetaxel/vinorelbina). Progresos recientes en el desarrollo de compuestos citotóxicos biológicos (anticuerpos monoclonales, inhibidores de citoquinas/quinasa, inmunoterapia/vacunas), han puesto de manifiesto su eficacia y especificidad frente a un subconjunto de tumores. Pero estos agentes se utilizan frecuentemente en combinación con compuestos citotóxicos químicos. A pesar de muchos 35 progresos en los desarrollos de nuevos fármacos citotóxicos, la resistencia de fármacos a la quimioterapia es, todavía, un asunto clínico importante en el tratamiento de los cánceres. La comprensión del mecanismo de resistencia a los fármacos en lo que respecta a la aceptación/efusión, degradación metabólica, mutagénesis de diana, reparación intensificada, indicación de muerte celular (apoptosis y necrosis), etc., es esencial para asegurar la eficacia de la quimioterapia y mejorar el índice terapéutico, 40 en especial, en algunos tumores resistentes a tratamiento.

La asociación entre quimioterapia y radioterapia se utiliza ampliamente para el tratamiento de cánceres. Aun cuando no ha sido completamente esclarecido todavía, los fundamentos biológicos de acción de los compuestos citotóxicos se basan en mecanismos celulares, tales como el ciclo celular o el daño del DNA, que son también factores importantes para la muerte celular inducida por las radiaciones, 45 que conducen a beneficios sinérgicos aditivos o incluso mejores, combinando tratamientos diferentes en la terapia del cáncer.

En la última década han sido llevadas a cabo muchas investigaciones en este campo. Comenzó a ser delineada la complejidad de la transducción de señales en respuesta a la radiación.

Entre los genes de interés particular para ser considerados dianas de las radiaciones ionizantes 50 están los implicados en la regulación de los mecanismos de mortalidad inducidos por radicaciones, tales como la apoptosis o la reparación del DNA. La muerte celular inducida por una radiación ionizante depende en la mayoría de los casos, de la reparación de DSBs.

Dos mecanismos están involucrados en la reparación de estas lesiones: la unión de extremos no homólogos (NHEJ, vía independiente de la secuencia) y la recombinación homóloga (HR, vía dependiente de la secuencia) (revisados por Jackson, 2002). La consideración como dianas de genes implicados en estas dos vías principales de reparación de DSB conduce a una radiosensibilidad pequeña o moderada, dependiendo de los enfoques utilizados y de las líneas de las células cancerosas (Belenkov et al., 2002; 5 Marangoni et al., 2000; Ohnishi et al., 1998).

Las proteínas Ku70 y Ku80, proteínas de DNA-PKsc, son importantes para reparar daños del DNA inducidos por radiaciones o por quimioterapia. Si el daño no pudiera ser reparado a tiempo, las células mueren. Por consiguiente, son dianas moleculares interesantes para sensibilizar células y tejidos diana a la radioterapia y a la quimioterapia. Muchos enfoques han sido concebidos y puestos en práctica 10 para inhibir estas proteínas clave (Ku70/Ku80, DNA-PKsc, etc.) implicadas en la vía NHEJ, considerada como predominante en células de mamífero:

1) Inhibidores de PI3K (fosfatidilinositol-3-quinasa)(es decir DNA-PKsc, PARP-1, ATM, ATR) (Boulton et al., 2000; Durant y Karran, 2003; Willmore et al., 2004; Vauger et al., 2004).

2) Dominante negativo y péptidos (extremo C-terminal de KU80) (Marangoni et al., 2000; Kim et 15 al., 2002).

3) Fragmento variable de anticuerpo monocatenario (scFv) (DNA-PKsc) (Li et al., 2003).

4) Tecnología de adaptación de DNA (SELEX: Ku que une RNA) (Yoo y Dynan, 1998).

5) Antisentido (Ku70, Ku80, DNA-PKsc) (Li et al., 2003b; Marangoni et al., 2000; Sak et al., 2002)

6) siRNA (DNA-PKsc) (Peng et al., 2000). 20

A pesar de estos enormes esfuerzos, la combinación de elección como dianas genes de reparación del DNA y terapias anticancerosas están todavía en fases experimentales precoces y no se han mostrado hasta la fecha estudios clínicos que manifiesten beneficios. Merece la pena hacer notar que los enfoques anteriores participan de una faceta común: estos enfoques consideran un único efector (proteína ) implicado en una vía compleja en cascada (tal como la NHEJ) con desviaciones posibles. 25

Besmer et al., (1998, Molecular Cell, 2, 817-828) describen moléculas de DNA de una longitud de 20 bp. El documento WO03/070914 describe siRNA, El documento WO03/069306 describe oligonucleótidos antisentido y siRNA.

Los inventores han descubierto que la sensibilidad tumoral a tratamientos terapéuticos anticancerosos directos o indirectos que dañan el DNA, puede intensificarse utilizando moléculas de 30 ácidos nucleicos de dobles cadenas. modificadas o no químicamente, que actúan como miméticos de fragmentos de DNA rotos y reconocidos como sitios DSB inducidos por los tratamientos que dañan el DNA. Las moléculas pueden tener estructura no replicativa debido a dichas modificaciones.

Un objeto de la invención es, por tanto, proporcionar tales fragmentos de ácidos nucleicos de dobles cadenas, denominados también en lo sucesivo moléculas de “mortalidad inducida por reparación 35 de DNA” (abreviadamente moléculas DRIL), capaces de intensificar la respuesta de tumores resistentes a tratamientos de radioterapia y quimioterapia.

Más particularmente, la invención pretende proporcionar nuevas moléculas DRIL para ser usadas en combinación con agentes físicos y químicos que pueden causar directa o indirectamente DSBs del DNA, y un método de tratamiento del cáncer que combina el uso de dichas moléculas DRIL con 40 terapias anticancerosas que ocasionan daño directo o indirecto del DNA.

Otro objeto de la invención se refiere al uso de moléculas...

1. Uso de una molécula de ácido nucleico que comprende una parte de doble cadena de 24-100 bp, que tiene al menos un extremo libre y que es sustrato de unión por al menos una proteína Ku involucrada en la vía NHEJ de reparación de roturas de dobles cadenas, para fabricar un medicamento para intensificar la sensibilidad tumoral a terapia anticancerosa que daña el DNA. 5

2. Uso de una molécula de ácido nucleico que comprende una parte de doble cadena de 24-100 bp, que tiene al menos un extremo libre y que es sustrato de unión por al menos una proteína Ku involucrada en la vía NHEJ de reparación de roturas de dobles cadenas, para fabricar un medicamento para tratar el cáncer en combinación con una terapia anticancerosa que daña el DNA.

3. Una molécula de ácido nucleico que comprende una parte de doble cadena de 24-100 bp, 10 que tiene al menos un extremo libre y que es sustrato de unión por al menos una proteína Ku involucrada en la vía NHEJ de reparación de roturas de dobles cadenas, para usar para tratar el cáncer en combinación con una terapia anticancerosa que daña el DNA.

4. El uso según la reivindicación 1 ó 2, o la molécula según la reivindicación 3, en la que dicha molécula es un fragmento de DNA. 15

5. El uso según la reivindicación 1, 2 ó 4, o la molécula según la reivindicación 3 ó 4, en la que dicha molécula es una molécula de ácido nucleico lineal o en forma de horquilla.

6. El uso o molécula según la reivindicación 5, en la que dicha molécula es una molécula de ácido nucleico en horquilla y en la que el lazo comprende ácido nucleico o grupos químicos.

7. El uso o molécula según la reivindicación 6, en la que el lazo es un engarce de 20 hexaetilenglicol o de tetradesoxitimidilato.

8. El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el extremo libre es romo o sobresale en 5' ó 3'-

9. El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha molécula inhibe in vitro la integración ilegítima de DNA exógeno intensificada por radiación 25

10. El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha molécula es capaz de ser captada por una célula en el núcleo celular.

11. El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha molécula comprende una estructura de fosfodiéster o una estructura de fosfodiéster modificada químicamente, u otra estructura con uno o varios grupos químicos. 30

12. El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha molécula comprende una estructura de 2'-desoxinucleótido y comprende, opcionalmente, uno o varios 2'-ribonucleótidos y/u otros nucleótidos modificados y/o nucleobases modificadas distintas de adenina, citosina, guanina y timina.

13. El uso o molécula según la reivindicación 11 ó 12, en la que dicha estructura comprende 35 metilfosfonatos, fosforamidatos, fosforotioato, ácido morfolino nucleico, ácido nucleico fijado por un puente de 2'-O,4'-C metileno/etileno , ácido nucleico peptídico (PNA), o ligamientos inter-azúcares de alquilos de cadena corta o cicloalquilos, o ligamientos de longitud variable intra-azúcares, heterocíclicos o heteroátomicos de cadena corta.

14. El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende, 40 además, miméticos de azúcares tales como 2'-O-alquilribosa, 2'-O-alquil-C4' ribosa ramificada, ciclobutilos u otros compuestos carbocíclicos o hexitol en lugar del grupo pentofuranosilo.

15. El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende uno o varios grupos químicos en el extremo de cada cadena o, al menos, en la cadena del extremo 3'.

16. El uso o molécula según la reivindicación 15, que comprende uno o varios fosforotioatos en 45 el extremo de cada cadena o, al menos, en la cadena del extremo 3'.

17. El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende, además, al menos un elemento incluido que estorba la replicación del DNA, la reparación del DNA, o el

proceso de indicación de daño, estando incorporado dicho al menos un elemento en el centro o en el extremo de la molécula de doble cadena.

18. El uso o molécula según la reivindicación 17, que comprende:

a) una cadena de polietilenglicol, preferiblemente una cadena de hexaetilenglicol o una cadena hidrocarbonada, opcionalmente interrumpida y/o sustituida por uno o más heteroátomos, por 5 ejemplo, oxígeno, azufre o nitrógeno, o grupos heteroatómicos o heterocíclicos, que comprenden uno o varios heteroátomos;

b) una unidad que es un elemento de bloqueo ya que no es aceptable por DNA polimerasas o exonucleasas, tal como cualesquiera nucleótidos modificados en la posición 3';

c)un oligonucleótido nativo tal como Tn, cuando se utiliza en el lazo de un fragmento en 10 horquilla, preferiblemente un tetradesoxitimidilato (T4).

19. El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que dicha molécula se obtiene mediante síntesis química, semi-biosíntesis o biosíntesis.

20. El uso según la reivindicación 1 ó 2 o la molécula según la reivindicación 3, en la que dicha molécula está seleccionada entre 15

DRIL32

DRIL32-FITC, DRID32-Cy3, DRIL32-Bt

en la que t es T marcada con fluoresceína para DRIL32-FITC, cianina-3 para DRIL32-Cy3 y biotina para DRIL32-Bt

DRIL 64

5

y

DRIL64-PEG

en la que las letras en negrita son nucleótidos con estructura de fosforotioato, la línea llena simboliza engarce de hexaetilenglicol y T4 se refiere a tetradesoxitimidilato. 10

21. El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la que la terapia anticancerosa que daña el DNA está seleccionada entre radioterapia y quimioterapia.

22. El uso o molécula según la reivindicación 21, en la que la molécula ha de ser administrada varias horas antes que la radioterapia.

23. El uso o molécula según la reivindicación 21, en la que la molécula ha de ser administrada 15 junto con quimioterapia.

24. El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en la que el cáncer es glioblastoma o cáncer de laringe.

25. El uso o molécula segín una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en la que el cáncer es un tumor altamente resistente a radioterapia y quimioterapia. 20

26. El uso o molécula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en la que la molécula ha de ser administrada mediante inyección intravenosa, intratumoral o subcutánea, o por vía oral.