Ácido nucleico promotor derivado de bacterias del género Corynebacterium, casete de expresión que comprende el promotor y el vector que comprende el casete, célula huésped que comprende el vector y procedimiento de expresión de un gen utilizando la célula.

Un promotor que comprende un polinucleótido de la SEC. ID Nº: 4.

Ácido nucleico promotor derivado de bacterias del género Cor y nebacterium, casete de expresión que comprende el promotor y el vector que comprende el casete, célula huésped que comprende el vector y procedimiento de expresión de un gen utilizando la célula.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo ácido nucleico promotor derivado de bacterias del género Cor y nebacterium, a un casete de expresión que incluye el mismo, a un vector que incluye el casete de expresión, a una célula huésped que incluye el vector y un procedimiento de expresión de un gen utilizando la célula huésped.

Técnica anterior

Las bacterias corineformes son microorganismos que se utilizan para producir varios materiales químicos usados en muchas aplicaciones, tales como piensos para animales, medicinas y alimentos, que incluyen L-lisina, L-treonina, y diversos ácidos nucleicos. A través de modificación por ingeniería genética y metabólica puede desarrollarse una cepa de bacterias corineformes que muestre una alta productividad. Para obtener dicha cepa de bacterias corineformes que muestren alta productividad, es necesario que, en la bacteria corineforme, se exprese un gen relacionado con diversas rutas metabólicas. Para esta finalidad, ha de desarrollarse un promotor adecuado.

Generalmente, en las bacterias corineformes, se expresa un gen bajo un promotor intrínsecamente incluido en el mismo. (Véase, por ejemplo, Journal of Bacteriology, 181 (19) , 6188-6191, 1999) . Sin embargo, no se conoce la estructura de una secuencia promotora que exprese un gen en bacterias corineformes, aunque se conocen las estructuras de otros microorganismos industriales, tales como E. coli y Bacillus subtilis. Por tanto, se ha sugerido el siguiente procedimiento para producir promotores que permitan la expresión de un gen en bacterias corineformes. Primero se elimina una región promotora de un gen que es resistente a un antibiótico, tal como cloranfenicol. Por otro lado, se escinde un ADN cromosómico separado de las bacterias corineformes utilizando una enzima de restricción adecuada, y el fragmento resultante se introduce en el gen al que se le ha eliminado la región promotora. Después, el gen obtenido se usa para transformar las bacterias corineformes para producir una nueva cepa transformada y se mide la resistencia al antibiótico de la cepa transformada: (véase Gene, 102, 93-98, 1991; Microbiology, 142, 1297-1309, 1996) . En particular, se ha desarrollado un número muy pequeño de promotores, un ácido nucleico que se sabe que produce el microorganismo, para utilizarse en Cor y nebacterium ammoniagenes. Por ejemplo, en E. coli, se utiliza un promotor que tiene una actividad aproximadamente un 10 % mayor que la de un promotor tac (véase Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003) . Sin embargo, cuando se usa en una expresión de genes masiva, un promotor de este tipo muestra una eficacia baja. La Patente de Estados Unidos Nº 5.593.781 desvela un promotor de ADN que se separa de una cepa de Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) y tiene una actividad mayor que la de un promotor tac. Sin embargo, dicho promotor de ADN que se separa del género Brevibacterium puede que no sea funcional en otras bacterias. Por tanto se necesita desarrollar una secuencia promotora que se derive de Cor y nebacterium ammoniagenes disponible comercialmente, y que tenga una alta actividad en otras bacterias.

Por consiguiente, los autores de la presente invención buscaban una secuencia promotora fuerte en Cor y nebacterium ammoniagenes y encontraron que un promotor, de acuerdo con la presente invención, puede expresar genes con alta actividad en Cor y nebacterium ammoniagenes.

Descripción de los dibujos La FIG. 1 muestra los resultados del ensayo de electroforesis bidimensional de una muestra extraída de una bacteria Cor y nebacterium ammoniagenes, en el que los resultados del ensayo se tiñeron con plata y se desarrollaron para su identificación; La FIG. 2 Ilustra un procedimiento de producción de un vector de selección de p117-gfp de acuerdo con una realización de la presente invención; y La FIG. 3 ilustra un procedimiento de producción de un vector recombinante que incluye la secuencia promotora pcj1 a pcj7 a partir de un vector de selección p117-gfp de acuerdo con una realización de la presente invención.

Descripción detallada de la invención Problema técnico La presente invención proporciona un promotor que tiene alta actividad en Cor y nebacterium.

La presente invención también proporciona un casete de expresión que incluye el promotor y un vector que incluye el casete de expresión.

La presente invención también proporciona una célula huésped que incluye el vector.

La presente invención también proporciona un procedimiento para expresar un gen utilizando la célula huésped.

Solución Técnica La presente invención proporciona un promotor que comprende un polinucleótido de la SEC. ID Nº: 4.

El promotor de acuerdo con la presente invención es un ácido nucleico aislado y tiene actividad promotora. En el presente documento, el término “promotor” se refiere a una región de ADN a la que se une una ARN polimerasa para iniciar la transcripción de un gen. La expresión “promotor tac” se refiere a un promotor obtenido por la fusión de una secuencia obtenida de la región- 35 de un promotor operón de triptófano de E. coli y una secuencia obtenida de la región -10 de un promotor operón de lactosa de E. coli. Se sabe que el promotor tac tiene una alta actividad promotora. Un promotor que tenga al menos un ácido nucleico seleccionado de las SEC. ID Nos 1, 4, 5, 6 y 7 tiene mayor actividad en las bacterias del género Cor y nebacterium que el promotor tac. En particular, un promotor que tenga al menos un ácido nucleico seleccionado de las SEC. ID Nos 1 y 4 tiene una actividad 10 veces más alta que la del promotor tac en bacterias del género Cor y nebacterium.

El promotor de acuerdo con una realización de la presente invención tiene actividad promotora en bacterias del género Escherichia, además de en bacterias del género Cor y nebacterium.

La célula en la que el promotor de la presente invención puede funcionar puede ser cualquiera de las bacterias del género Cor y nebacterium. Como ejemplos de bacterias del género Cor y nebacterium se incluyen Cor y nebacterium ammoniagenes CJHB100 (KC-CM-10330) y ATCC 6871, Cor y nebacterium glutamicum ATCC 13032 y ATCC 13060, y similares. Sin embargo, las bacterias del género Cor y nebacterium no están limitadas a éstas. Como ejemplos de bacterias del género Escherichia, en los que puede funcionar un promotor de acuerdo con una realización de la presente invención, se incluyen E. coli.

La secuencia del promotor de acuerdo con una realización de la presente invención puede cambiarla fácilmente un experto habitual en la técnica a través de un proceso de mutagénesis conocido, tal como evolución directa y mutagénesis dirigida. Por consiguiente, está dentro del ámbito de la presente invención un ácido nucleico que tenga, por ejemplo, una homología del 70 % o más, preferentemente una homología del 80 % o más y más preferentemente una homología del 90 % o más, con la secuencia del promotor aislado que incluye al menos un ácido nucleico seleccionado de la SEC. ID Nº: 4, y que puede actuar como un promotor en bacterias del género Cor y nebacterium.

La presente invención también proporciona un casete de expresión que incluye el promotor que está unido operativamente a una secuencia codificante. La secuencia codificante puede ser, por ejemplo, todo el gen o una secuencia codificante que codifique una región predeterminada del gen. En el presente documento, la expresión “unido operativamente” indica que la secuencia codificante está funcionalmente conectada al promotor de tal forma que la secuencia promotora puede iniciar o mediar la transcripción de la secuencia codificante. El casete de acuerdo con una realización de la presente invención puede incluir adicionalmente secuencias de control 5’ y 3’ unidas operativamente a la secuencia promotora. La secuencia codificante puede ser un gen asociado a un producto metabólico, tal como IMP, GMP, L-lisina y L-treonina.

La presente invención también proporciona un vector que incluye el casete de expresión de acuerdo con una realización de la presente invención. En el presente documento, el vector no está limitado, y puede ser cualquier vector conocido en la técnica. Como ejemplos del vector de acuerdo con las realizaciones de la presente invención se incluyen el vector CR2.1-TOPO (producido de Invitrogen Inc, USA) y pECCG117 (KFCC-10673) . Sin embargo, el vector no se limita a estos.... [Seguir leyendo]

1. Un promotor que comprende un polinucleótido de la SEC. ID Nº: 4.

2. Un casete de expresión que comprende el promotor de la reivindicación 1 y que está unido operativamente a una secuencia codificante.

3. Un vector que comprende el casete de expresión de la reivindicación 2.

4. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 3.

5. La célula huésped de la reivindicación 4 que es una célula bacteriana que pertenece al género Cor y nebacterium o al género Escherichia.

6. Un procedimiento de expresión de un gen exógeno que comprende cultivar la célula huésped de las 10 reivindicaciones 4 o 5.