Control de referencia para análisis célula a célula.

Un control de referencia congelado para el análisis célula a célula en un analizador de tipo citómetro de flujo que comprende:

análogos celulares formados de células sanguíneas permeadas que contienen en su interior proteínas intracelulares agregadas y uno o más sitios antigénicos de los mismos conservados, que tienen una membrana celular permeable a un anticuerpo; y

una solución de almacenamiento que comprende una sal en una concentración de 0,05 M a 2 M y un sacárido en una concentración de 0,1 M a 2 M, en donde dicha solución de almacenamiento no contiene agentes protectores que interfieren con el análisis que deba llevarse a cabo;

en donde dichos análogos celulares se suspenden en dicha solución de almacenamiento y dichos análogos celulares mantienen dichos uno o más sitios antigénicos conservados de dichas proteínas después de descongelar dicho control de referencia congelado.

Control de referencia para análisis célula a célula Campo de la invención

La presente invención se refiere a un control de referencia que contiene análogos celulares formados de células sanguíneas permeadas que contienen proteínas intracelulares agregadas y sitios antigénicos conservados.

Antecedentes de la invención

La medición cuantitativa de componentes celulares en un análisis célula a célula se lleva a cabo habitualmente sobre un citómetro o sobre un analizador hematológico. Una muestra de sangre se prepara utilizando un reactivo o reactivos específicos y procedimientos específicos y la presencia de componentes celulares se determina utilizando señales de dispersión de luz y de fluorescencia medidas sobre dichos analizadores. Muchos factores físicos o químicos pueden tener un efecto en la relación del componente celular objeto de análisis presente en la célula y la salida de señal del analizador de medición. Sin un control o referencia adecuados, es difícil obtener una medición cuantitativa precisa del componente celular en cuestión. Puede incluirse un control de referencia en las mediciones de una serie de muestras, como un control externo, o bien puede añadirse un control de referencia a cada muestra que desea medirse, a modo de control interno. En este último caso, es necesario que el analizador pueda diferenciar entre un componente celular del control de referencia y el componente celular de las células sanguíneas en la muestra que se está midiendo.

Un control de referencia puede contener una partícula sintética, por ejemplo, una partícula de látex cubierta con un componente celular objeto de análisis en una cantidad conocida. Otros controles de referencia contienen células sanguíneas estabilizadas que tienen cantidades conocidas de componentes celulares objeto de análisis y que son estables durante un período de tiempo dado a una temperatura baja, pero superior al punto de congelación.

Puesto que la variación de señal no es solamente debida a variaciones inherentes al instrumento de medición, sino también a variaciones en la preparación de las muestras para la medición, las partículas de un control de referencia, preferiblemente, se comportan de modo similar a las células sanguíneas de la muestra en la condición de preparación de muestra. En este sentido, las células sanguíneas estabilizadas tienen una ventaja frente a las partículas sintéticas. Sin embargo, los componentes celulares o las propiedades antigénicas de los componentes celulares a menudo se deterioran en el proceso de preparación de las células de control o durante su almacenamiento a una temperatura superior a la de congelación.

El congelamiento de las células y el almacenamiento a temperaturas ultra bajas solucionaría el problema de la degradación de las células de control con el transcurso del tiempo. Sin embargo, los cristales de hielo intracelulares dañan la membrana celular, y deben tomarse precauciones especiales, por ejemplo, la adición de agentes protectores tales como glicerol o dimetilsulfóxido para proteger las células durante el ciclo de congelación y descongelación. Sin embargo, incluso si no están dañadas, las células tratadas a menudo presentan modificaciones sustanciales tras el ciclo de congelación y descongelación que influyen en la posterior medición. Además, los agentes protectores pueden interferir también con el ensayo que deba realizarse.

Por lo tanto, es deseable que las células utilizadas en el control de referencia tengan una morfología celular comparable a la de las células sanguíneas que deben someterse a análisis y que tengan componentes celulares conservados y antígenos conservados de los componentes celulares que deban medirse, y que las células del control de referencia puedan ser sometidas a ciclos de congelación y descongelación sin deteriorar la morfología celular ni los antígenos de los componentes celulares.

Además, aunque puede utilizarse un control de referencia con un valor conocido de un parámetro de interés para corregir la variabilidad interanalítica, es deseable tener un control interno que contenga células marcadas para corregir la variabilidad intraanalítica y la variabilidad interanalítica. El mareaje de las células en un control de referencia hace posible que el instrumento de medición pueda diferenciar entre las células de la muestra que desea medirse y las células de control añadidas a la muestra y utilizar dichas células marcadas como un control interno del proceso de medición.

Además, en las pruebas analíticas célula a célula para medir los componentes intracelulares utilizando anticuerpos u otras muestras moleculares, es necesario permear la membrana celular de modo que los anticuerpos u otras muestras moleculares puedan penetrar a través de la membrana celular. Para dichas pruebas analíticas, es deseable utilizar un control de referencia que contenga células que tengan su membrana celular ya permeada, lo que hace posible que las muestras grandes, como por ejemplo los anticuerpos, penetren a través de ella.

En US-4.777.139 (Wong y col.) se describe un control hematológico con componentes de glóbulos rojos de estabilidad mejorada. Wong y col. describen la exposición de glóbulos rojos lavados a un aldehido insaturado, como por ejemplo acroleína (propenal), en condiciones suficientes para aumentar la estabilidad de las células sin afectar a la capacidad de lisis celular por parte de un reactivo lítico. Tras el tratamiento, las células tratadas se lavan y se

suspenden en un medio de suspensión estabilizante. El control de referencia se almacena a una temperatura baja, pero superior al punto de congelación. Las membranas de dichas células estabilizadoras no son permeadas.

La hemoglobina celular de los glóbulos rojos es un parámetro importante para el diagnóstico clínico. En la mayoría de los analizadores hematológicos, la concentración total de hemoglobina de una muestra de sangre se obtiene Usando los glóbulos rojos en una muestra de sangre con un reactivo lítico y midiendo un cromógeno formado por las moléculas de hemoglobina liberadas mediante una medición espectrofotométrica. La hemoglobina corpuscular media (HCM) de una muestra de sangre se obtiene a partir del número de glóbulos rojos (RBC) y de la concentración total de hemoglobina de la muestra de sangre. La HMC es un valor promedio de todos los glóbulos rojos y no representa el contenido de hemoglobina de los glóbulos rojos por separado.

En cambio, la medición de la hemoglobina celular en un citómetro de flujo es una medición célula a célula que proporciona información diagnóstica no disponible mediante la HMC. Campbell y col. en Cytometry 35, págs. 242- 248 (1999), llevaron a cabo una prueba con un citómetro de flujo para analizar la hemoglobina en glóbulos rojos individuales utilizando un anticuerpo anti-hemoglobina A fluorescente. Burshteyn y col. (documento de publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 24/214243) llevaron a cabo una prueba analítica con un citómetro de flujo para analizar la hemoglobina utilizando un anticuerpo anti-pan hemoglobina. Puesto que los glóbulos rojos tienen una alta concentración de hemoglobina, para medir el total de hemoglobina celular utilizando anticuerpos se requiere una gran cantidad de anticuerpos marcados con fluorescencia. Además, existen posibles efectos debidos al impedimento estérico de la unión de anticuerpos o de la extinción de la fluorescencia debido a la elevada densidad de la hemoglobina en la célula. Por lo tanto, es deseable disponer de un método que permita medir la hemoglobina celular total sin tener que depender del uso de anticuerpos.

La identificación y/o cuantificación de variantes y de formas aberrantes de hemoglobina es importante para el diagnóstico clínico de diversas enfermedades, por ejemplo, la anemia drepanocítica, la talasemia y la diabetes. La medición de la hemoglobina Aic ha sido una de las mediciones de variante de hemoglobina utilizadas con mayor frecuencia y es una medición clínica importante en el caso de los enfermos de diabetes.

Se sabe que aproximadamente el 9% de la hemoglobina total es no glicosilada. La mayor parte de la hemoglobina no glicosilada es HbA no glicosilada, conocida como HbAO. La hemoglobina glicada consiste en a una serie de componentes minoritarios de la hemoglobina que se forman debido a la unión de diversos azúcares a la molécula de hemoglobina. El eritrocito humano es completamente permeable a la glucosa. En cada eritrocito, la hemoglobina glicada se forma a una velocidad que es directamente proporcional a la concentración de glucosa en el entorno. La reacción de glucosa con hemoglobina es no enzimática, irreversible y lenta, de modo que solamente... [Seguir leyendo]

Un control de referencia congelado para el análisis célula a célula en un analizador de tipo citómetro de flujo que comprende:

análogos celulares formados de células sanguíneas permeadas que contienen en su interior proteínas intracelulares agregadas y uno o más sitios antigénicos de los mismos conservados, que tienen una membrana celular permeable a un anticuerpo; y

una solución de almacenamiento que comprende una sal en una concentración de ,5 M a 2 M y un sacárido en una concentración de ,1 M a 2 M, en donde dicha solución de almacenamiento no contiene agentes protectores que interfieren con el análisis que deba llevarse a cabo;

en donde dichos análogos celulares se suspenden en dicha solución de almacenamiento y dichos análogos celulares mantienen dichos uno o más sitios antigénicos conservados de dichas proteínas después de descongelar dicho control de referencia congelado.

El control de referencia de la reivindicación 1, en donde dichos análogos celulares están formados de células sanguíneas de un individuo que tiene un nivel normal o anormal de un antígeno de interés.

El control de referencia de la reivindicación 2, en donde dicho individuo es un mamífero, un ave, o un reptil.

El control de referencia de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichos análogos celulares son análogos de glóbulos rojos formados de glóbulos rojos permeados que comprenden sitios antigénicos conservados de una o más variantes de hemoglobina.

El control de referencia de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichos análogos celulares comprenden además un marcador celular unido a uno o más componentes celulares de dichas células sanguíneas permeadas.

El control de referencia de la reivindicación 5, en donde dicho marcador celular es un tinte fluorescente.

El control de referencia de la reivindicación 6, en donde dicho tinte fluorescente es éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE).

El control de referencia de la reivindicación 4, en donde dichos análogos celulares y dicha solución de almacenamiento se congelan, y dichos análogos celulares mantienen dichos sitios antigénicos conservados de dichas una o más variantes de hemoglobina tras la descongelación.