Anticuerpos monoclonales capaces de reaccionar con una pluralidad de subtipos del virus de la influenza A.

Un anticuerpo monoclonal humano dirigido contra el antígeno hemaglutinina del virus de la influenza A,

caracterizado porque es capaz de unirse a una pluralidad de subtipos del virus de la influenza A y neutralizarlos, en donde dicha pluralidad de subtipos comprende, al menos, un subtipo del virus de la influenza A que contiene hemaglutinina H1 y, al menos, un subtipo del virus de la influenza A que contiene hemaglutinina H3.

Anticuerpos monoclonales capaces de reaccionar con una pluralidad de subtipos del virus de la influenza A

En general, la presente invención pertenece al campo de la Inmunología. Más específicamente, la Invención se refiere a anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno HA (hemaglutlnlna) del virus de la Influenza A.

Antecedentes de ¡a invención

La epidemia anual del virus de la Influenza representa una causa Importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. En los Estados Unidos de América se estima que más de 200,000 personas son hospitalizadas cada año por síndromes asociados con los virus de la Influenza, y aproximadamente 40,000 muertes están relacionadas directamente con la misma (Thompson ef a/., JAMA, 2003, 289:179-186). Aparte de estas cifras, también se deben considerar los casos, en números exponenclalmente más altos, de sujetos Infectados que permanecen en sus casas durante periodos más o menos largos, con repercusiones económicas Inevitables debido a la pérdida de días de trabajo. Un estudio reciente (Mollnarl ef a/., t/acc/ne, 2007, 25: 5086-5096) ha calculado que los costos médicos relacionados directamente con las epidemias anuales son de 10.4 billones de dólares estadounidenses al año, a los cuales se deben agregar 16.3 billones de dólares estadounidenses por los Ingresos perdidos debido a la ausencia del trabajo. Si en el cálculo también se consideran otras cuestiones, tales como la monetización de las pérdidas económicas vinculadas con la muerte de los sujetos Infectados, la cantidad se eleva a la increíble cifra de 87.1 billones de dólares estadounidenses. Estos datos económicos vinculados con las epidemias anuales, junto con el temor de una pandemia que pudiera ocurrir en cualquier momento en un futuro cercano debido a la aparición de virus de la influenza nuevos para el hombre, explican el considerable Interés en la búsqueda de estrategias efectivas para contener la diseminación de estos virus.

Actualmente, la única herramienta disponible para enfrentar de alguna forma las epidemias anuales de influenza, es una vacuna trivalente desactivada que contiene antígenos virales aislados que presumiblemente serían responsables de la epidemia de la siguiente estación de influenza. Este tipo de predicción, basada en datos epidemiológicos vinculados con aislamientos tempranos en algunas zonas geográficas centinelas, no siempre resulta correcta. Por lo tanto, existe el riesgo considerable, que está presente cada año, de que la vacuna trivalente desarrollada para una cierta estación de influenza pudiera ser sustancialmente ineficaz.

En ese caso, así como también en el caso de una pandemia nueva, la única ayuda profiláctica/terapéutica disponible sería recurrir a las dos clases disponibles de fármacos antivirales: los inhibidores de la proteína M2 (amantadina y rimantadina), y los inhibidores de neuraminidasa (oseltamivir y zanamivir). Sin embargo, también en esta situación son de esperar una serie de problemas relacionados con la necesidad de administrar los antivirales en una etapa muy temprana de la infección, y la rápida aparición de aislados virales resistentes, que no obstante ya ha ocurrido.

Una estrategia alternativa eficaz se podría basar en preparaciones de anticuerpo neutralizante dirigidas contra proteínas virales críticas, capaces de reconocer porciones de estas proteínas que son compartidas por los diferentes

aislados del virus de la influenza.

Para una mejor comprensión del potencial de un enfoque basado en la administración pasiva de anticuerpos, es útil mencionar brevemente las principales características estructurales de los virus de la influenza. Los virus de la influenza pertenecen a la familia Orf/?omyxov;ncfae y se caracterizan por la presencia de una envoltura derivada de membranas celulares infectadas, sobre la cual están presentes aproximadamente 500 púas, también llamadas proyecciones. Estas proyecciones consisten en trímeros y tetrámeros de dos importantes proteínas de superficie viral: hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). En la superficie de la envoltura también se encuentra una proteína de membrana integral (M2), dicha proteína está presente en cantidades mucho más bajas en comparación con la hemaglutinina y neuraminidasa, y también se organiza en tetrámeros.

Además, el virus de la influenza se caracteriza por la presencia, dentro del núcleo, de un genoma segmentado comprendido de 8 fragmentos de ARN de una sola cadena. Basándose en las características de algunas proteínas dentro del virión (NP y M1), son distinguibles tres tipos de virus de influenza: el tipo A, el tipo B y el tipo C.

Los virus del tipo A y del tipo B son responsables de las epidemias anuales. En cambio, los virus del tipo C son responsables de síndromes menos severos.

Dentro de los virus del tipo A (los únicos responsables de pandemias y capaces de ocasionar los síndromes más severos Incluso durante las epidemias anuales), también son distinguibles diferentes subtipos por las características antlgénlcas de la hemaglutinina y neuraminidasa. Los subtipos que han afectado a los humanos en el curso de la historia reciente son los subtipos H1N1 y H3N2 (todavía en circulación actualmente y contenidos en preparaciones de vacuna), así como también el subtipo H2N2, fuera de circulación desde 1968 y responsable de la llamada gripe asiática en 1957. Otros subtipos han afectado esporádicamente a los humanos (H9N2, H7N7 y el reciente subtipo H5N1 tan temido), pero no han podido extenderse eficientemente y desplazar a los subtipos en circulación.

La función de las proteínas de superficie es esencial en el ciclo de duplicación viral. En particular, la hemaglutinina es la proteína que permite a los virus reconocer el ácido siálico presente sobre la superficie de algunas células e Infectarlas. En cambio, la neuramlnldasa opera al final del ciclo de duplicación viral, que es durante la liberación de partículas virales nuevas de las células Infectadas. Su función es ayudar a la liberación de hemaglutinina de los viriones recién formados del ácido siálico presente en la superficie de la célula que los produjo. La función clave desempeñada por estas dos proteínas, así como su despliegue sobre la superficie del virus, explican porqué representan el blanco principal de la respuesta Inmune, y porqué son susceptibles de una tasa de mutación elevada. De hecho, las epidemias anuales son causadas por virus que son más o menos diferentes de los virus de los años anteriores, y por lo tanto son capaces de escapar más o menos eficientemente de la respuesta inmune que estimulan. En otras palabras, la acumulación progresiva de mutaciones de punto en la hemaglutinina (principalmente) y neuraminldasa (secundariamente) hace a los anticuerpos protectores, producidos durante las epidemias previas, en general progresivamente Ineficaces.

La función protectora principal de la respuesta inmune contra la influenza es desempeñada por el componente humoral. Los anticuerpos ejercen su función protectora obstaculizando la unión de la hemaglutinina al ácido siálico, Impidiendo con ello la infección de las células. Esta presión selectiva determina la tasa de mutación elevada en la hemaglutinina. Estudios de secuencia realizados entre 1968 y 1999 sobre el subtipo H3 de hemaglutinina han revelado un total de 101 mutaciones de aminoácidos (en un total de aproximadamente 560 aminoácidos), con un promedio de aproximadamente 3.5 mutaciones por año. Sesenta por ciento de las mutaciones que ocurrieron en el periodo estudiado fueron retenidas en los virus en circulación también el año siguiente, lo que es indicativo de la persistencia de una presión selectiva mediada por la inmunidad. El 95% de estas mutaciones se encontraron en la subunldad de hemaglutinina HA1, que es la directamente implicada en la unión con el ácido siálico. Sin embargo, dentro de esta variabilidad elevada se han encontrado residuos de aminoácidos sin cambio, lo que es indicativo de su papel esencial en la función de la proteína. Estas porciones de hemaglutinina representan un blanco potencial para una respuesta neutralizante cruzada hacia los diferentes subtipos del virus de la influenza. Sin embargo, es predecible que tales reglones no serán capaces de inducir una respuesta de anticuerpo eficaz en la mayoría de los pacientes, pues el hecho de que tales blancos se ocultan en áreas inmunosilenciosas ha representado ciertamente un paso evolutivo muy favorable para el virus.

De hecho, al referirse a la Inmunidad contra la influenza se deben tomar en cuenta tres tipos de inmunidad diferentes, que pueden ser bien entendidos a la luz de los datos arriba mencionados:

INMUNIDAD HOMOLOGA: Relacionada con el aislado individual.... [Seguir leyendo]

1.- Un anticuerpo monoclonal humano dirigido contra el antígeno hemaglutinina del virus de la influenza A, caracterizado porque es capaz de unirse a una pluralidad de subtipos del virus de la influenza A y neutralizarlos, en donde dicha pluralidad de subtipos comprende, al menos, un subtipo del virus de la influenza A que contiene hemaglutinina H1 y, al menos, un subtipo del virus de la influenza A que contiene hemaglutinina H3.

2.- Un anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1que comprende por lo menos un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, el dominio variable de cadena pesada teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y el dominio variable de cadena ligera teniendo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

3.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 2que comprende por lo menos un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, el dominio variable de cadena pesada codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, y el dominio variable de cadena ligera codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4.

4.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1que es capaz de unirse al epítopo conformacional de hemaglutinina reconocido específicamente por el anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 2.

5.- Un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4que se selecciona del grupo que consiste en inmunoglobulinas completas y fragmentos de inmunoglobulina que comprenden por lo menos un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera.

6.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 5, en donde dichos fragmentos de inmunoglobulina se seleccionan del grupo que comprende fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, anticuerpos de una sola cadena (scFv).

7.- Un anticuerpo anti-idiotipo que está dirigido específicamente contra el idiotipo de un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8.- Secuencias de nucleótidos aisladas SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

9.- Un vector de expresión que comprende las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

10.- Una célula hospedera transformada por un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 9.

11.- Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de por lo menos un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 7, y un vehículo y/o diluente farmacéuticamente aceptable.

12.- Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para usarse en un tratamiento profiláctico o terapéutico para una Infección por el virus de la Influenza A, o una enfermedad causada directa o indirectamente por una infección del virus de la influenza A.

13.- El anticuerpo para usar de conformidad con la reivindicación 12, en donde la enfermedad causada por una Infección del virus de la Influenza A es el síndrome de Influenza.

14.- Un método de prueba para detectar, en una muestra biológica de un paciente, la presencia de anticuerpos contra el virus de la Influenza que tienen una propiedad neutralizante cruzada de heterosubtlpo, que comprende poner en contacto dicha muestra biológica con un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 como reactivo de prueba específico.

15.- Un kit de diagnóstico que comprende un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 como reactivo específico, dicho kit diseñado particularmente para usarse en un método de detección o cuantlflcaclón de anticuerpos contra el virus de la Influenza A que tienen una propiedad neutralizante cruzada de heterosubtlpo, en una muestra biológica obtenida de un paciente.

16.- Un método de prueba para detectar, en una composición ¡nmunogénlca o de vacuna, la presencia de epítopos del virus de la Influenza A capaces de provocar anticuerpos contra el virus de la Influenza A que tienen una propiedad neutralizante cruzada de heterosubtlpo contra el virus de la Influenza A, en un sujeto en el que se administra, que comprende poner en contacto dicha composición con un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 como reactivo de prueba específico.