Novedosas aplicaciones de compuestos de acridinio y derivados en ensayos homogéneos.

Un ensayo homogéneo para detección o cuantificación de un analito en una muestra,

que comprende las siguientes etapas:

(a) conjugación del analito a un compuesto de acridinio quimioluminiscente seleccionado del grupo consistente de un éster de acridinio con grupos funcionales donantes de electrones en la posición C2 y/o C7 sobre el núcleo de acridinio o una sulfonamida de acridinio con o sin grupos funcionales donantes de electrones en la posición C2 y/o C7 sobre el núcleo de acridinio;

(b) adición de una cantidad predeterminada del conjugado a la muestra que contiene la concentración desconocida del analito;

(c) agregar un anticuerpo específico para el analito para formar un complejo de enlazamiento bien sea con el analito o con su conjugado de acridinio;

(d) incubar la solución del complejo de enlazamiento;

(e) disparar la quimioluminiscencia de la mezcla de reacción del complejo de enlazamiento agregando reactivos disparadores de la quimioluminiscencia en un rango de pH de 6 a 10 para producir emisión de luz;

(f) medir la cantidad de emisión de luz con un luminómetro: y

(g) calcular la concentración del analito comparando la cantidad de luz emitida desde la mezcla de reacción con una curva de respuesta a la dosis estándar la cual relaciona la cantidad de luz emitida con una concentración conocida del analito.

Novedosas aplicaciones de compuestos de acridinio y derivados en ensayos homogéneos Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se relaciona con la aplicación de compuestos de acridinio con ciertas características estructurales específicas en ensayos homogéneos. Se divulgan aquí características estructurales importantes que son necesarias para asegurar una emisión de luz a pH moderado.

2. Antecedentes de la invención

Los ésteres de acridinio quimioluminiscentes (AE) son marcadores extremadamente útiles que han sido utilizados extensamente en inmunoensayos y en ensayos de ácidos nucleicos. Las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,745,181; 4,918,192, 5,110,932; 5,241,070; 5,538,901; 5,663,074 y 5,656,426 divulgan una variedad de ésteres de acridinio estables con diferentes grupos funcionales para conjugación a una variedad de moléculas biológicamente activas denominadas analitos.

La Patente de los Estados Unidos No. 5, 656,426 divulga un éster de acridinio hidrofílico con rendimiento de cuantos incrementado. Se han dirigido esfuerzos considerables también hacia el diseño de ésteres de acridinio cuya longitud de onda de emisión pueda ser alterada bien sea incorporando características estructurales únicas en el éster de acridinio o empleando el principio de transferencia de energía. Véanse las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5, 395,752; 5, 702,887; 5, 879,894 y 6, 355,803.

Las sulfonamidas de acridinio son otra clase de compuestos quimioluminiscentes en donde el grupo fenólico saliente sustituido es reemplazado con una sulfonamida sustituida. La síntesis y aplicaciones de estos compuestos de acridinio en ensayos heterogéneos han sido descritos en la técnica anterior: Adamczyk et al, Tetrahedron, vol. S5, páginas 10899-10914 (1999); Mattingly, J. Biolumín. Chemílumín., vol. 6, páginas 107-114 (1991); y Adamcyzk et al, Bioconjugate Chem, vol. 11, páginas 714-724 (2000).

Wilson et al (Anal. Chem 2001, 73, 763-767) divulga el efectos del pH y la concentración de peróxido en el ECL del DMC.

Mecanísticamente, el tratamiento con ácido convierte la forma pseudobase del compuesto de acridinio al éster de acridinio el cual puede participar entonces en la reacción quimioluminiscente con peróxido de hidrógeno. La adición de álcalis sirve no solamente neutralizar el ácido sino también para elevar el pH del medio de reacción para la ionización del peróxido de hidrógeno.

Los reactivos relativamente agresivos con pH fuertemente ácido del orden de menos de 2 y pH fuertemente básico del orden de más de 12 que son requeridos para disparar la quimioluminiscencia como se describe anteriormente son nocivos para la preservación de complejos enlazantes tales como los complejos anticuerpo-hapteno o híbridos de ácidos nucleicos. Este no es un problema en un formato de ensayo heterogéneo en donde la generación de señal se lleva a cabo típicamente al final del ensayo y donde se han retirado sustancias trazadoras no enlazadas y/o ¡nterferentes.

Un ensayo homogéneo es un método analítico en donde la medición de una sustancia de interés se lleva a cabo sin ningún procedimiento de separación. En un formato de ensayo homogéneo, con el fin de detectar la ocurrencia de eventos de enlazamiento utilizando compuestos de acridinio quimioluminiscentes como marcadores, la generación de luz debe ocurrir bajo condiciones de pH moderadas porque las condiciones de pH agresivas son nocivas para la preservación de los complejos enlazantes. Adicionalmente, se requiere de un mecanismo para distinguir entre trazador o analito enlazado y no enlazado porque no se lleva a cabo ninguna separación en un ensayo homogéneo. Estas restricciones han perturbado la utilidad de los compuestos de acridinio de ensayos homogéneos.

Los únicos ensayos homogéneos que utilizan compuestos de acridinio que se cree que han sido descritos en la literatura son ensayos de protección de hibridación. Véase Nelson et al, Biochemistry vol. 35, páginas 8429-8438 (1996). En estos ensayos, la porción de éster de acridinio de una sonda de ácido nucleico marcada con éster de acridinio es descompuesta selectivamente por hidrólisis cuando no está hibridizada a un objetivo. La hibridación de la sonda subjetiva da como resultado la protección del éster de acridinio frente a la hidrólisis permitiendo por lo tanto la distinción entre ADN hibridado versus no hibridado. Empleando ésteres de acridinio con ratas de hidrólisis similares pero diferentes perfiles de emisión de luz dependientes del tiempo, se diseñaron ensayos multianalito homogéneos para detectar ácidos nucleicos.

En Nelson et al, la estructura del éster de acridinio no está siendo alterada para permitir la emisión de luz bajo condiciones moderadas. En vez de esto, el ensayo de Nelson at al, tiene la ventaja de las diferentes ratas de

hidrólisis (degradación) del áster de acridinio cuando un ácido nucleico marcado con el áster de acridinio es libre o esta hibridado a la secuencia complementaria del ácido nucleico marcado con áster de acridinio. Así, la propiedad del ácido nucleico, bien sea o no hibridado a su secuencia complementaria, está siendo usada para alterar la rata de degradación del áster de acridinio.

La transferencia de energía por resonancia en fluorescencia (FRET) es un fenómeno bien conocido que ha sido usado ampliamente para estudiar los efectos de proximidad en las biomoléculas. En la FRET, una molécula donante fluorescente excitada electrónicamente transfiere su energía electrónica a una segunda molécula receptora a través de acoplamiento dipolo-dipolo. Esta transferencia de energía produce detención de la fluorescencia del donante. Si el receptor es fluorescente, se observa entonces su fluorescencia.

La eficiencia de la transferencia de energía es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia que separa los fluorescentes donante y receptor y también depende directamente del rendimiento en cuanto fluorescentes del donante y el coeficiente de extinción del receptor en la longitud de onda de emisión máxima del donante. Debido a la dependencia de la distancia, la FRET normalmente no se observa a distancias >10 nm.

Los inmunoensayos homogéneos basados en transferencia de energía de quimioluminiscencia también han sido 15 descritos utilizando isoluminol como donante quimioluminiscente y fluoresceína como receptor. Véase Patel et al, Clin, Chem. Vol. 29/9, páginas 1604-1608 (1983). Los ensayos para analitos pequeños tales como la progesterona así como antígenos de proteína fueron construidos utilizando el par donante-receptor isoluminol-fluoresceína presumiblemente porque la quimioluminiscencia del isoluminol puede ser disparada bajo condiciones moderadas.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1 a 10 son todas representaciones gráficas.

La figura 1 representa titulaciones de pH de áster de dimetil acridinio (DMAE);

La figura 2 representa titulaciones de pH de 2,7-dimetoxi-DMAE;

La figura 3 representa un ensayo homogéneo de carbamazepina usando un trazador de éster de acridinio;

La figura 4 representa un ensayo homogéneo de carbamazepina utilizando un trazador de acridinio sulfonamida;

La figura 5 representa un ensayo homogéneo de teofilina utilizando un trazador de éster de acridinio;

La figura 6 representa un ensayo homogéneo de teofilina utilizando un trazador de acridinio sulfonamida;

La figura 7 representa un ensayo homogéneo de valproato utilizando un trazador de éster de acridinio;

La figura 8 representa un ensayo homogéneo de valproato utilizando un trazador de acridinio sulfonamida;

La figura 9 representa un ensayo homogéneo de valproato utilizando un detenedor;

La figura 10 representa una CL RET de Biotin-AE a Biotin-jfNpFL en un complejo de estreptavidina.

Descripción de las realizaciones preferidas

Esta invención comprende ciertos compuestos de acridinio que incluyen ásteres de acridinio y sulfonamidas de acridinio cuya quimioluminiscencia puede ser disparada bajo condiciones de pH relativamente moderadas. La disponibilidad de tales compuestos de acridinio cuya quimioluminiscencia puede ser disparada bajo condiciones 35 relativamente moderadas hace posible utilizar tales compuestos en ensayos de transferencia de energía en resonancia homogénea. Se ha descubierto inesperadamente, que trazadores de hapteno derivados de estos compuestos de acridinio muestran diferencias significativas en su eficiencia de producción de luz dependiendo de si están libres en solución o enlazados a sus anticuerpos respectivos. El descubrimiento de este fenómeno ha permitido la producción de ensayos... [Seguir leyendo]

1. Un ensayo homogéneo para detección o cuantificación de un analito en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

(a) conjugación del analito a un compuesto de acridinio quimioluminiscente seleccionado del grupo consistente de un éster de acridinio con grupos funcionales donantes de electrones en la posición C2 y/o C7 sobre el núcleo de acridinio o una sulfonamida de acridinio con o sin grupos funcionales donantes de electrones en la posición C2 y/o C7 sobre el núcleo de acridinio;

(b) adición de una cantidad predeterminada del conjugado a la muestra que contiene la concentración desconocida del analito;

(c) agregar un anticuerpo específico para el analito para formar un complejo de enlazamiento bien sea con el analito o con su conjugado de acridinio;

(d) incubar la solución del complejo de enlazamiento;

(e) disparar la quimioluminiscencia de la mezcla de reacción del complejo de enlazamiento agregando reactivos disparadores de la quimioluminiscencia en un rango de pH de 6 a 10 para producir emisión de luz;

(f) medir la cantidad de emisión de luz con un luminómetro: y

(g) calcular la concentración del analito comparando la cantidad de luz emitida desde la mezcla de reacción con una curva de respuesta a la dosis estándar la cual relaciona la cantidad de luz emitida con una concentración conocida del analito.

2. El ensayo de la reivindicación 1, en donde el compuesto de acridinio es un éster de acridinio o una sulfonamida de acridinio.

3. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde dicho compuesto de acridinio quimioluminiscente tiene la siguiente estructura:

A-

R1

en donde,

R1 es un alquilo, alquenilo, alquinilo o aralquilo que contiene hasta 20 heteroátomos; o un grupo sulfopropilo o sulfobutilo;

X es oxígeno o nitrógeno;

Y es un alquilo de cadena ramificada o recta que contiene hasta 20 átomos de carbono, halogenado o no halogenado, o un arilo sustituido, o un sistema de anillo heterocíclico;

donde X es oxígeno, Z se omite e Y es una unidad estructural arilo polisustituido de la fórmula:

en donde R4 y R8 son el mismo o diferentes, y son hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi (-OR), alquiltiol (- SR) o grupos amino sustituidos que sirven para estabilizar el enlace -COX- entre el núcleo acridinio y la unidad estructural Y, a través de un efecto estérico y/o electrónico;

R5 y R7 son hidrógeno o lo mismo que R;

R6 = -R9-R10,

en donde R9 no es requerido y es un alquilo de cadena ramificada o recta, arilo o aralquilo sustituido o no sustituido que contiene hasta 20 heteroátomos, y

R10 es un grupo saliente o un grupo funcional electrofílico unido con un grupo saliente seleccionado del grupo 10 consistente de:

-SO2CI, -N3, -N2<+> Cl< - >, un haluro o un ácido carboxílico, R5 y R6, y R6 y R7 son intercambiables; cuando x es 15 nitrógeno, Z es -SO2-Y, e Y tiene la misma definición de Y y ambos pueden ser el mismo o diferentes; W1 y W2 son el mismo o diferentes y son grupos donantes de electrones que comprenden OR, OH, SR, SH, NH2, NRR; en donde R, R y R pueden ser el mismo o diferentes, y son seleccionados del grupo consistente de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y aralquilo que contienen hasta 20 heteroátomos;

A< - > es un contraión el cual es introducido para aparearse con el nitrógeno cuaternario de dicho núcleo de 20 acridinio, y es seleccionado del grupo consistente de CH3S04<->, FSO3 <->, CF3SC>4<-> C4F9SO4 <->, CH3C6H4SO3 <->, haluro, CF3COO <->, CH3COO <->, y NO3 <->.

4. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el analito de interés es una molécula pequeña seleccionada del grupo consistente de esteroides, fármacos terapéuticos, vitaminas, hormonas y péptidos.

5. El ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el agente disparador de la quimioluminiscencia es 25 peróxido de hidrógeno, peróxido de sodio o sales de peróxido bivalentes.