Método y dispositivo para para llevar a cabo un recuento sanguíneo.

Un método para contar células sanguíneas en una muestra de sangre entera,

método que comprende las etapas de:

(a) depositar la muestra de sangre entera sobre un portaobjetos;

(b) emplear un extendedor para crear un frotis sanguíneo;

(c) permitir que el frotis sanguíneo se seque sobre el portaobjetos;

(d) medir un valor de absorción o reflectancia de luz atribuible a la hemoglobina de los hematíes en el frotis sanguíneo del portaobjetos para identificar un área de análisis;

(e) registrar una imagen digital bidimensional aumentada del área de análisis identificada mediante la medición de la etapa (d) como de espesor adecuado para el análisis; y

(f) tomar, analizar y almacenar datos de la imagen digital bidimensional;

donde las células sanguíneas son contadas en el área de análisis y se dividen por un volumen de sangre calculado para dicha área determinando la relación de la densidad óptica de dicha área respecto a la densidad óptica del frotis sanguíneo completo, teniendo en cuenta el volumen de sangre que forma el frotis.

Método y dispositivo para para llevar a cabo un recuento sanguíneo ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención

Esta Invención se refiere a un método para llevar a cabo un recuento sanguíneo por medio de un frotis sanguíneo. Discusión de la técnica

El recuento automatizado de células sanguíneas habitualmente implica realizar el recuento de células sanguíneas después de obtener una muestra de sangre entera que tenga un volumen conocido y que posteriormente haya sido diluida en un diluyente apropiado. Conocer el volumen inicial de la muestra y el grado de dilución posterior permite realizar una determinación cuantitativa del número de los diferentes tipos de células en el volumen dado de la muestra original de sangre entera. Por ejemplo, si se diluye un microlltro de sangre entera de tal modo que dé lugar a un volumen de 1 microlitros, se dice que la razón de dilución es 1:1, y se dice que el factor de dilución es de 1. SI un recuento sanguíneo de esta muestra diluida indica que hay 5 hematíes por microlitro, el recuento de hematíes de la muestra de sangre original no diluida es igual a producto de 1 y 5, es decir, 5... Por tanto, el recuento sanguíneo real de la muestra no diluida es de 5.. de hematíes por microlitro.

Se han empleado varios métodos físicos para detectar y numerar hematíes, tales como, por ejemplo, el análisis de las características de impedancia de los hematíes por medio de corriente directa o de señales de radiofrecuencia, el uso de cltometría de flujo óptica, donde las células, que están teñidas o en su estado casi nativo, son examinadas a través de sus características de dispersión de luz, sus características de absorbancia, sus características de fluorescencia o cualquier combinación de lo anterior. También se ha sugerido que los hematíes se pueden cuantlflcar mediante obtención directa de imágenes de las células sanguíneas en combinación con análisis de Imágenes microscópicas de las células sanguíneas mediante citometría de flujo, o con las células sanguíneas en suspensión en una cámara de dimensiones especificadas. Se han desarrollado instrumentos en los que se pueden Introducir muestras de sangre tanto diluidas como sin diluir en una cámara de conteo, cuyas dimensiones son conocidas, y se puede generar un recuento sanguíneo a través del análisis de imágenes digitales. Se pueden usar todas estas estrategias para generar los parámetros de un recuento sanguíneo.

Una vez que se ha completado un recuento sanguíneo mediante uno de los métodos mencionados, un número de las muestras sanguíneas habitualmente requieren de un análisis adicional por medio de un proceso que implica preparación, tinción y examen de un frotis sanguíneo. El proceso de análisis de un frotis sanguíneo puede emplear una variedad de técnicas, que incluyen técnicas manuales, automatizadas o semi-automatizadas. El análisis de un frotis sanguíneo se puede usar para confirmar la precisión de un recuento sanguíneo, para detectar potenciales sustancias que interfieran, y para detectar algunas de las características sub-celulares finas de las células que no pueden detectarse o interpretarse mediante los análisis convencionales de un recuento sanguíneo.

Las células sanguíneas no son homogéneas. Las células sanguíneas contienen rasgos subcelulares que son más pequeños que las propias células. Dichos rasgos subcelulares incluyen núcleos, nucléolos, gránulos y membranas celulares. Los ejemplos particulares de análisis de rasgos subcelulares incluyen el examen de las formas de los hematíes y de las variaciones en las formas de los hematíes. Por ejemplo, es posible determinar la relación entre el tamaño del núcleo de la célula y el tamaño de la propia célula midiendo el área transversal de cada uno de ellos (es decir, del núcleo de la célula y de la propia célula) y dividiendo los valores medidos. Dicha relación, y otros parámetros diversos, se pueden usar para determinar el grado de normalidad de una célula sanguínea.

Las sustancias que potencialmente interfieren incluyen, aunque sin limitación, células falciformes, hematíes resistentes a lisis, células que se agregan por diversas razones, hematíes nucleados, y concentraciones de lípidos inusualmente elevadas. Generalmente, estas sustancias ¡nterferentes son anormalidades de la(s) estructura(s) de el(los) constituyente(s) de la sangre, anormalidades que alteran las características reflectivas y absortivas normales de los constituyentes de la sangre, características normales que permite la medición de los parámetros sanguíneos.

Con respecto al análisis de un frotis sanguíneo, después de preparar un frotis sanguíneo, el frotis sanguíneo puede ser teñido con al menos un tinte apropiado para identificar las características morfológicas de las células sanguíneas y de los rasgos subcelulares de las células sanguíneas. El proceso de identificación puede ser manual o automatizado. Típicamente, un frotis sanguíneo teñido es examinado por un morfologista humano, quien determina de forma subjetiva las apariencias morfológicas de las células para proporcionar impresiones cuantitativas de las proporciones de diferentes leucocitos o impresiones semi-cuantitativas del grado de anormalidad morfológica. También se han realizado intentos de automatizar el proceso de análisis de un frotis sanguíneo por medio de microscopios automatizados y de software de reconocimiento de patrones en imágenes digitales no solo para clasificar leucocitos sino también para proporcionar una interpretación de los cambios morfológicos. Por ejemplo, se han realizado esfuerzos para desarrollar técnicas que puedan usarse para detectar automáticamente el área de trabajo de un frotis sanguíneo periférico que haya sido teñido con un tinte de May-Grunwald Giemsa usando una

combinación de procedimientos de análisis de imágenes y de técnicas de análisis de partículas. Véase Angula et al., Automated detection of working area of peripheral blood smears using mathematical morphology, Analytical Cellular Pathology 25 (23) 37-49.

Por tanto, la realización de un recuento sanguíneo y el posterior análisis morfológico de una muestra sanguínea requiere etapas discretas que pueden implicar el procesamiento de la muestra de sangre a través de un dispositivo de recuento sanguíneo automatizado, formando y tiñendo un frotis sanguíneo de la muestra de sangre, tanto manualmente como por medio de un dispositivo automatizado, seguido de una revisión morfológica del frotis sanguíneo teñido, tanto manualmente como por medio de un dispositivo automatizado.

Aunque las prácticas descritas previamente tienen un uso extendido, y aunque la determinación semi-cuantitativa de células es posible a través de una revisión morfológica, nunca se ha sugerido llevar a cabo un recuento sanguíneo completo cuantitativo con un frotis sanguíneo. Dicho proceso tiene dos limitaciones inherentes. Cuando se extiende una muestra de sangre para formar un frotis sanguíneo, el volumen de sangre usado para formar el frotis sanguíneo no se puede controlar suficientemente hasta el punto de obtener una estimación precisa del volumen de sangre, con el resultado de que no puede obtenerse el número absoluto de células presentes en el frotis sanguíneo. Además, aunque se han desarrollado dispositivos en los que se puede depositar una monocapa de un frotis sanguíneo, dichos dispositivos habitualmente se basan en una centrifugación para distribuir células uniformemente por toda la superficie de un portaobjetos de microscopio de forma rectangular. En la Figura 1A, se designa un porta de microscopio con la referencia numérica 1, y se designa una gota de sangre con la referencia numérica 12a. En la Figura 1B, el porta de microscopio se designa con la referencia numérica 1, y el frotis sanguíneo se designa con la referencia numérica 12b. La flecha 14 representa la dirección de rotación del porta de microscopio 1 durante el proceso de centrifugación. Típicamente, un volumen desconocido de muestra de sangre se pierde del porta de microscopio durante el proceso de centrifugación. Puesto que la cantidad de células perdidas es desconocida e impredecible, no se puede realizar una estimación precisa del volumen de sangre que queda sobre el porta del microscopio al final del análisis. Por lo tanto, solo se puede obtener una información limitada respecto a las proporciones celulares de la muestra de sangre, y no se puede obtener ninguna información que requiera el conocimiento del volumen total de muestra de sangre. En efecto, no se pueden realizar mediciones para la determinación de la concentración de células.

Existen dos estrategias alternativas usadas actualmente para preparar frotis sanguíneos. La primera estrategia,... [Seguir leyendo]

1. Un método para contar células sanguíneas en una muestra de sangre entera, método que comprende las etapas de:

(a) depositar la muestra de sangre entera sobre un portaobjetos;

(b) emplear un extendedor para crear un frotis sanguíneo;

(c) permitir que el frotis sanguíneo se seque sobre el portaobjetos;

(d) medir un valor de absorción o reflectancia de luz atribuible a la hemoglobina de los hematíes en el frotis sanguíneo del portaobjetos para Identificar un área de análisis;

(e) registrar una imagen digital bidlmenslonal aumentada del área de análisis identificada mediante la medición de la etapa (d) como de espesor adecuado para el análisis; y

(f) tomar, analizar y almacenar datos de la Imagen digital bidimensional;

donde las células sanguíneas son contadas en el área de análisis y se dividen por un volumen de sangre calculado para dicha área determinando la relación de la densidad óptica de dicha área respecto a la densidad óptica del frotis sanguíneo completo, teniendo en cuenta el volumen de sangre que forma el frotis.

2. El método de la reivindicación 1, que además comprende fijar y teñir la muestra.

3. El método de la reivindicación 1, donde la concentración de hemoglobina de la muestra de sangre entera se deriva de un volumen conocido de sangre depositada sobre el portaobjetos.

4. El método de la reivindicación 1, donde la concentración de hemoglobina de la muestra de sangre entera se calcula en el punto de aspiración de la muestra, y se mide la densidad óptica de un frotis sanguíneo preparado a partir de la muestra, proporcionando con ello información sobre el volumen de la muestra de sangre entera depositada sobre el portaobjetos.

5. El método de la reivindicación 1, que además comprende analizar la imagen digital bidimensional para contabilizar el número de leucocitos de la muestra, el número de hematíes de la muestra, el número de plaquetas de la muestra y/o para determinar un recuento sanguíneo completo para la muestra.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la medición de un valor de absorción o de reflectancia de luz atribuible a la hemoglobina del frotis sanguíneo comprende la determinación de si el valor de absorción o de reflectancia está por debajo de un valor de corte superior y por encima de un valor de corte inferior.

7. Un dispositivo para contar células sanguíneas en una muestra de sangre entera, dispositivo que comprende:

(a) un soporte para presentar un recipiente que contenga una muestra de sangre entera a un dispositivo de aspiración/dispensador, un dispositivo de aspiración/dispensador para extraer una muestra de sangre entera del recipiente y depositar la muestra de sangre entera sobre un portaobjetos, p.ej., un portaobjetos

de microscopio;

(b) un extendedor para extender la muestra de sangre entera por el portaobjetos para crear un frotis

sanguíneo;

(c) un secador para secar el frotis sanguíneo sobre el portaobjetos;

(d) un primer sistema de obtención de imágenes para medir la absorción o la reflectancia de luz en función de la hemoglobina de los hematíes de la película extendida sobre el portaobjetos para identificar un área de

análisis;

(e) un segundo sistema de obtención de imágenes capaz de registrar una imagen digital bidimensional aumentada del área de análisis identificada por el primer sistema de obtención de imágenes como de espesor adecuado para el análisis; y

(f) un ordenador para tomar, analizar y almacenar los resultados de la imagen digital bidimensional aumentada, que se caracteriza porque el dispositivo está configurado para llevar a cabo los métodos de cualquiera de las Reivindicaciones 1-6.

8. El dispositivo de la reivindicación 7, que además comprende un posicionador para posicionar el porta para permitir un procesamiento adicional del frotis sanguíneo.

9. El dispositivo de la reivindicación 7, donde la concentración de hemoglobina de la muestra de sangre entera se deriva de un volumen conocido de sangre depositada sobre el porta.

1. El dispositivo de la reivindicación 7, donde la concentración de hemoglobina de la muestra de sangre entera se calcula en el punto de aspiración de la muestra, y se mide la densidad óptica de un frotis sanguíneo preparado a partir de la muestra, proporcionando con ello información del volumen de la muestra de sangre entera depositado sobre el portaobjetos.

11. El dispositivo de la reivindicación 7, donde a partir del frotis sanguíneo se calcula un recuento de leucocitos, un

recuento de hematíes, un recuento de plaquetas y/o un recuento sanguíneo completo.