DISPOSITIVO DE CULTIVO CELULAR Y MÉTODO ASOCIADO A DICHO DISPOSITIVO.

Dispositivo de cultivo celular y método asociado a dicho dispositivo.

La presente invención se refiere a un dispositivo encapsulable destinado para su uso en el estudio de cultivos celulares, y compuesto preferentemente de un material plástico donde se localizan diferentes pocillos para el cultivo celular, en el fondo de los cuales se deposita un material gelificado con propiedades mecánicas diferentes en cada pocillo. la invención tiene por objeto, preferentemente, la obtención de sistemas de análisis a gran escala que permitan hacer el estudio de la respuesta de un determinado tipo de células, fármacos, etc. en función de diferentes valores de rigidez del sustrato empleados para cada cultivo.

Dispositivo de cultivo celular y método asociado a dicho dispositivo

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención hace referencia a un dispositivo encapsulable de tipo “laboratorio en chip” (o, en inglés, “lab-on-chip”) destinado para su uso en el alojamiento y el estudio de cultivos celulares, así como a un método de fabricación de dicho dispositivo. Más concretamente, la invención se refiere a un dispositivo orientado a proporcionar una cámara de cultivo microfluídica equipada con una pluralidad de pocillos, sobre los que se encuentra depositada una matriz (o “array”) de sustratos, donde dichos sustratos depositados en cada pocillo presentan, preferentemente, distintos valores de rigidez.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Actualmente, dentro del campo técnico correspondiente al estudio del comportamiento celular sobre disposiciones de sustratos (definidos como las superficies donde se depositan las muestras biológicas durante su cultivo) , es conocido en el estado de la técnica que las propiedades mecánicas de dichos sustratos poseen un importante efecto en el comportamiento y evolución de los cultivos estudiados. Dentro de las propiedades mecánicas que afectan al desarrollo de los cultivos, según lo publicado en estudios de alto impacto científico (en revistas como Science, Cell, etc.) , la rigidez de los mismos posee una especial relevancia en su comportamiento. Ello ha motivado, en los grupos de investigación especializada en este campo, una necesidad creciente de obtener muestras de experimentación sobre sustratos de diferente rigidez, lo que ha llevado a la obtención de algunos dispositivos experimentales destinados a tal fin. Dado que dichos dispositivos, hasta la fecha, han de ser desarrollados por cada laboratorio de forma individual, adaptándose a las necesidades concretas de cada experimento, y que dichos dispositivos no pueden aplicarse, por lo general, a más de un uso o experimento, existe hoy en día una importante carencia tecnológica de producción a gran escala de este tipo de plataformas de cultivo.

Es por ello que se plantea, en el estado de la técnica, la necesidad de desarrollar sistemas de análisis a gran escala (o “screening” masivo) que permitan, en un solo uso, hacer el estudio de la respuesta de los cultivos celulares en función de diferentes valores de rigidez del sustrato y realizar una caracterización rápida y sencilla de las células estudiadas, ya sean solas o bajo la influencia de agentes externos (drogas, agentes bioquímicos, etc.) .

La presente invención está orientada a satisfacer dicha necesidad.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN

Tal y como se ha descrito en párrafos precedentes, la presente invención se refiere a un dispositivo encapsulable de tipo “lab-on-chip”, destinado para su uso en el estudio de cultivos celulares, y compuesto preferentemente de un material plástico donde se localizan diferentes áreas o pocillos para el cultivo celular, en el fondo de los cuales se deposita un material gelificado con propiedades mecánicas diferentes en cada pocillo. Dicho dispositivo obedece al objeto principal de la presente invención, que consiste en la obtención de sistemas de análisis a gran escala que permitan hacer el estudio de la respuesta de un determinado tipo de células, fármacos, efecto sobre crecimiento, etc. en función de diferentes valores de rigidez del sustrato, en los que el usuario pueda realizar estudios de cultivo celular.

El citado objeto de la invención se realiza, en un primer aspecto de la misma, mediante un dispositivo de cultivo celular caracterizado porque comprende:

- un generador de geles que comprende, al menos, dos canales de entrada de fluidos y un mezclador conectado a dichos canales de entrada de fluidos, estando el mezclador configurado para crear un gradiente discreto de mezclado a través de una estructura de ramificación por etapas, y donde el generador de geles comprende, adicionalmente, una pluralidad de canales de salida, conectados al mezclador en una o más de sus etapas de ramificación;

- una cámara de cultivo celular que comprende una pluralidad de pocillos de cultivo celular conectados a los canales de salida del generador de geles, de forma que se puedan depositar dichos geles como sustratos de los pocillos, y donde la cámara de cultivo celular comprende, asimismo, al menos un canal de entrada de fluido y, al menos, un canal de salida de fluido, estando ambos canales conectados a dicha cámara de cultivo celular.

En una realización preferente de la presente invención, la cámara de cultivo celular es una cámara encapsulable. Se consigue con ello facilitar la preparación de los cultivos, mediante el uso exclusivamente de los canales o microcanales del dispositivo, para la inyección de los sustratos, células y medio de cultivo, sin la necesidad de intervención manual adicional. La posibilidad de encapsular el dispositivo proporciona, asimismo, mayor robustez al mismo.

En otra realización preferente de la invención, el dispositivo está realizado como un chip basado en un material polimerizable mediante fotolitografía. Se consigue con ello una herramienta implementable a través de las técnicas de producción en masa conocidas en el campo de la fabricación de chips semiconductores, lo que proporciona una forma eficaz para el estudio en masa de cultivos, y su producción con costes competitivos. Preferentemente, el material de fabricación polimerizable del dispositivo comprende un polímero viscoso epoxi SU-8.

Otro objeto de la presente invención se refiere a un método de cultivo celular que comprende el uso de un dispositivo según las realizaciones descritas en el presente documento, donde se hacen circular líquidos de distinta composición a través de los canales de entrada del generador de geles, de forma que los geles generados en los canales de salida de dicho generador de geles se depositen, por medio de la conexión con los pocillos de la cámara de cultivo celular, como sustratos de diferente rigidez de dichos pocillos. Preferentemente, las células cultivadas son introducidas en la cámara de cultivo, sobre los sustratos de los pocillos de dicha cámara.

En una realización preferente del método de cultivo celular de la invención, se hace circular un líquido biocompatible y/o un medio de cultivo a través de los canales de entrada y salida de la cámara de cultivo.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método de fabricación de un dispositivo según las realizaciones aquí descritas, que comprende la polimerización mediante fotolitografía de capas polimerizables que conforman un chip mediante su unión.

Dentro de las ventajas aportadas por el dispositivo de la invención, destacan las siguientes:

- Los valores de rigidez de la matriz de sustratos del dispositivo son conocidos con exactitud por el usuario.

- Los valores de rigidez pueden ser prefijados por el usuario mediante la modificación de los componentes líquidos que dan lugar al gel en el mezclador.

- El gradiente de rigidez producido varía en cantidades discretas y prefijadas, a diferencia de un gradiente continuo, donde las variaciones de rigidez son difíciles de determinar.

- La presencia de canales de entrada y salida en la cámara de cultivo permite la realización de experimentos a largo plazo (manteniendo dicha entrada y salida como canales de alimentación de un medio de cultivo) , sin necesidad de intervención externa del usuario.

- La presencia de un flujo de líquido biocompatible o un medio de cultivo durante el cultivo celular permite, asimismo, la simulación de condiciones de tensión de cizalladura en los cultivos, lo que permite el estudio de los mismos, sometidos a dicha tensión. La principal ventaja del dispositivo es que facilita el testeo masivo de diferentes sustratos, con propiedades diferentes de rigidez, en un solo uso, de forma automática y sin la necesidad de preparación previa de cada pocillo. Se trata de un dispositivo que no existe actualmente en el mercado, lo que provoca que cada centro de investigación deba invertir cierto tiempo y esfuerzo a cubrir ese vacío, desarrollando sistemas propios.

Adicionalmente a las ya planteadas, otras características y ventajas de la invención se desprenderán de la descripción que sigue, así como de las figuras que acompañan al presente documento.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra una representación de los elementos del dispositivo de la invención, en una realización preferente de la misma (planta) .

La Figura 2 muestra una representación de la estructura del generador de geles del dispositivo de cultivo celular, en una realización...

1. Dispositivo de cultivo celular caracterizado porque comprende:

- un generador de geles (1) que comprende, al menos, dos canales de entrada (2, 3) de fluidos y un mezclador

(4) conectado a dichos canales de entrada (2, 3) de líquidos, estando el mezclador (4) configurado para crear un gradiente de mezclado a través de una estructura de ramificación por etapas, y donde el generador de geles (1) comprende, adicionalmente, una pluralidad de canales de salida (5) , conectados al mezclador en una o más de sus etapas de ramificación;

- una cámara de cultivo celular (6) que comprende una pluralidad de pocillos (7) de cultivo celular conectados a los canales de salida (5) del generador de geles (1) , de forma que se puedan depositar dichos geles como sustratos de los pocillos (7) , y donde la cámara de cultivo celular (6) comprende, asimismo, al menos un canal de entrada de fluido (8) y, al menos, un canal de salida de fluido (9) , estando ambos canales conectados a dicha cámara de cultivo celular (6) .

2. Dispositivo según la reivindicación anterior, donde la cámara de cultivo celular (6) es una cámara encapsulable.

3. Dispositivo de cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por estar realizado como un chip basado en un material polimerizable mediante fotolitografía.

4. Dispositivo según la reivindicación anterior, donde el material polimerizable comprende SU-8.

5. Método de cultivo celular que comprende el uso de un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y donde se hace circular líquidos de distinta composición a través los canales de entrada (2, 3) del generador de geles (1) , de forma que los geles generados en los canales de salida (5) de dicho generador de geles se depositen, por medio de la conexión con los pocillos (7) de la cámara de cultivo celular (6) , como sustratos de diferente rigidez de dichos pocillos (7) .

6. Método según la reivindicación anterior, que comprende, asimismo, la introducción de las células cultivadas en la cámara de cultivo (6) , sobre los sustratos de los pocillos (7) de dicha cámara (6) .

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5-6, donde se hace circular un líquido biocompatible y/o un medio de cultivo a través de los canales de entrada y salida de la cámara de cultivo.

8. Método de fabricación de un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende la polimerización mediante fotolitografía de capas polimerizables que conforman un chip mediante su unión.

9. Método de fabricación según la reivindicación anterior, que comprende los siguientes pasos:

- una capa metálica (10) es depositada sobre una primera superficie de soporte (11) ;

- una primera capa de SU-8 (12) es depositada sobre la capa metálica (10) de la primera superficie de soporte (11) , y definida mediante fotolitografía para ser usada como capa suelo del mezclador (4) de componentes de los geles;

- una segunda capa de SU-8 (13) se deposita sobre la primera capa de SU-8 (12) de la primera superficie de soporte (11) , y es definida mediante fotolitografía para fabricar los canales que van a ser utilizados para la mezcla de los componentes de los geles, y la localización de las áreas/pocillos (7) asignados;

- una tercera capa de SU-8 (14) se deposita sobre una segunda superficie de soporte (15) que comprende un material (16) con baja adherencia al SU-8, definiéndose dicha tercera capa (14) mediante fotolitografía, para hacer de tapa de las estructuras definidas en la primera superficie de soporte (11) , excepto las entradas y salidas fluídicas, para poder acceder a los canales (2, 3, 5) ;

- la segunda superficie de soporte (15) se enfrenta a la primera superficie de soporte (11) , de forma que las capas de SU-8 (12, 13, 14) comprendidas en dichas superficies queden enfrentadas y alineadas entre sí, pegándose las capas de SU-8 (12, 13, 14) de ambas superficies (11, 15) a través de la aplicación de presión y temperatura;

-la segunda superficie de soporte (15) es liberada de la primera superficie de soporte (11) a través del material

(16) con baja adherencia al SU-8, dejando las capas primera (12) , segunda (13) y tercera (14) de SU-8 sobre la primera superficie de soporte (11) ;

- la oblea formada por la unión de las capas (10 12, 13, 14) de la primera (11) y la segunda (15) superficie de soporte es introducida en un encapsulado, donde se realizan conexiones fluídicas sobre las entradas y salidas a los canales de SU-8 para introducir los componentes de los geles y, por tanto, para realizar la mezcla deseada, localizando las diferentes mezclas en las áreas/pocillos (7) asignados;

- se deposita una capa metálica (17) sobre una tercera superficie de soporte (18) ;

- una cuarta capa de SU-8 (19) se deposita sobre la capa metálica (17) de la tercera superficie de soporte (18) y se define a través de procesos de fotolitografía para ser usada como capa suelo del dispositivo final;

- la tercera superficie de soporte (18) se enfrenta a la primera superficie de soporte (11) , de forma que las capas de SU-8 (12, 13, 14, 19) depositadas sobre cada una de dichas superficies (11, 18) queden enfrentadas y alineadas entre sí, y las capas de SU-8 de ambas superficies (12, 13, 14, 19) son pegadas a través de la aplicación de presión y temperatura;

- la oblea formada por las capas de las superficies de soporte primera (11) y tercera (18) , pegadas entre sí por medio de las capas de SU-8 (12, 13, 14, 19) , es introducida en un agente químico para disolver selectivamente la capa metálica (10) de la primera superficie de soporte (11) , de forma que todas las capas de SU-8 (12, 13, 14, 19) quedan adheridas a la tercera superficie de soporte (18) ;

- se deposita una quinta capa de SU-8 (20) sobre una cuarta superficie de soporte (21) que comprende un material (22) con baja adherencia al SU-8, y se define a través de procesos de fotolitografía para ser usada como capa techo del dispositivo final;

- se deposita una sexta capa de SU-8 (23) sobre la quinta capa de SU-8 (20) de la cuarta superficie de soporte (21) , y se define a través de procesos de fotolitografía para ser usada como capa de cámara de cultivo del dispositivo final;

- la cuarta superficie de soporte (21) se enfrenta a la tercera superficie de soporte (18) , de forma que las capas de SU-8 (12, 13, 14, 19, 20, 23) depositadas sobre cada una de dichas superficies queden enfrentadas y alineadas entre sí, y las capas de SU-8 (12, 13, 14, 19, 20, 23) de ambas superficies de soporte son pegadas a través de la aplicación de presión y temperatura;

- las seis capas de SU-8 (12, 13, 14, 19, 20, 23) son liberadas de las superficies de soporte restantes (18, 21) , mediante la introducción de la oblea formada por dichas capas en un atacante químico selectivo para la capa metálica (17) de la tercera superficie de soporte (18) , y mediante la retirada de la cuarta superficie de soporte

(21) que comprende el material (22) con baja adherencia al SU-8.

10. Método según la reivindicación anterior, donde el material (16, 22) con baja adherencia a SU-8 comprende kapton.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, donde las capas metálicas (10, 17) comprenden aluminio o cromo.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde la capa metálica (10) de la primera superficie de soporte (11) comprende un metal diferente al metal de la capa metálica (17) de la tercera superficie de soporte (18) .

FIG. 1

FIG. 2 FIG. 3 FIG. 4 FIG. 5

Fig. 6a

Fig. 6b

Fig. 6c

Fig. 7a

Fig. 7b

Fig. 7c

Fig. 8a

Fig. 8b

Fig. 8c

FIG. 9 FIG. 10