Clones de ADN infecciosos quiméricos, circovirus porcinos quiméricos y usos de los mismos.

Una molécula de ácido nucleico quimérico del circovirus porcino (PCV1-2) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un PCV1 no patógeno que contiene un gen de la cápside del marco de lectura abierto inmunogénico ORF2 de un PCV2 patógeno en el lugar de la misma posición del gen de ORF en la molécula de ácido nucleico de PCV1,

en la que el gen de ORF2 del PCV2 inmunogénico comprende una guanina en la posición del nucleótido 328 (mutación de C a G) y una citosina en la posición del nucleótido 573 (mutación A a C).

Clones de ADN infecciosos quiméricos, circovirus porcinos quiméricos y usos de los mismos Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere a clones de ADN infecciosos de PCV1-2 quiméricos y a virus quiméricos derivados de clones de ADN quiméricos útiles como vacunas. La invención se refiere adicionalmente a dos mutaciones en el gen de la cápside inmunogénica del PCV 2 y la proteína y a la introducción de mutaciones del ORF2 en los clones quiméricos.

Descripción de la técnica relacionada El circovirus porcino (PCV) se aisló originalmente como un contaminante de cultivo de células no citopáticas de una línea celular de riñón porcina PK-15 I. Tischer y col., "A ver y small porcine virus with circular single-stranded DNA, " Nature 295:64 -66 (1982) ; I. Tischer y col., "Characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines, " Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226 (2) :153 -167 (1974) ) . El PCV es un pequeño virus icosahédrico sin envuelta que contiene un genoma de ADN circular monocatenario de aproximadamente 1, 76 kb. El PCV está clasificado en la familia de Circoviridae, junto con otros circovirus de animales diferentes tales como el virus de la anemia del pollo (CAV) , el virus de la enfermedad de pico y pluma de Psittacine (PBFDV) y los posibles miembros del circovirus de colúmbidos (CoCV) descubierto en palomas, el circovirus del ganso y el circovirus del canario) y tres circovirus de plantas (virus del cogollo racimoso del banano, virus de la podredumbre foliar del cocotero y virus de malformación del trébol subterráneo) (K.V. Phenix y col., "Nucleotide sequence analysis of a novel circovirus of canaries and its relationship to other members of the genus circovirus of the family Circoviridae, "

J. Gen. Virol. 82:2805 -2809 (2001) ; Todd y col., "Genome sequence determinations and analyses of novel circoviruses from goose and pigeon, " Virology 286:354 -362 (2001) ; M. R. Bassami y col., "Psittacine beak and feather disease virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus, plant circoviruses, and chicken anemia virus, " Virology 249:453 -459 (1998) ; J. Mankertz y col., "Transcription analysis of porcine circovirus (PCV) , " Virus Genes 16:267 -276 (1998) ; A. Mankertz y col., "Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV) , a new circovirus from pigeons, " Arch. Virol. 145:2469 -2479 (2000) ; B. M. Meehan y col., "Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses, " J. Gen. Virol. 78:221 -227 (1997) ; B. M. Meehan y col., "Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs, " J. Gen. Virol. 79:2171 -2179 (1998) ; D. Todd y col., "Comparison of three animal viruses with circular single-stranded DNA genomes, " Arch. Virol.

117:129 -135 (1991) ) .

Los miembros de los tres circovirus animales reconocidos previamente (PCV, CAV y PBFDV) no comparten la homología de secuencias de nucleótidos o determinantes antigénicos entre sí (M. R. Bassami y col., 1998, citado anteriormente; D. Todd y col., 1991, citado anteriormente) . El genoma del CoCV recientemente identificado compartía aproximadamente el 40 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la de PCV (A. Mankertz y col., "Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV) , a new circovirus from pigeons, " Arch. Virol. 145:2469 -2479 (2000) ) . Recientemente se ha identificado un nuevo circovirus humano con un genoma circular, denominado virus transmitido por transfusión o virus TT (TTV) en individuos asociado a hepatitis después de transfusión (H. Miyata y col., "Identification of a novel GC-rich 113-nucleotide region to complete the circular, single-stranded DNA genome of TT virus, the first human circovirus, " J. Virol. 73:3582 -3586 (1999) ; T. Nishizawa y col., "A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology, " Biochem. Biophys. Res. Commun. 241:92 -97 (1997) ) . De manera adicional, se ha identificado un minivirus humano de tipo TTV (TLMV) a partir de sangre de donantes normales P. Biagini y col., "Genetic analysis of full-length genomes and subgenomic sequences of TT virus-like mini virus human isolates, " J. Gen. Virol. 82: 379 -383 (2001) ; K. Takahashi y col., "Identification of a new human DNA virus (TTV-like mini virus, TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus, " Arch. Virol. 145:979 -93 (2000) ) y también se ha descubierto un tercer circovirus humano nuevo, conocido como virus SEN (SENV) en seres humanos con hepatitis postransfusional (T. Umemura y col., "SEN virus infection and its relationship to transfusion-associated hepatitis, " Hepathology 33:1303 -1311 (2001) ) . La organización genómica tanto del TTV como del TLMV humanos es similar al del CAV CAV (P. Biagini y col., 2001, citado anteriormente; H. Miyata y col., 1999, citado anteriormente; K. Takahashi y col., 2000, citado anteriormente) . Aunque se encontraron anticuerpos contra el PCV en diversas especies animales incluyendo seres humanos, ratones, ganado vacuno y cerdos (G. M. Allan y col., "Production, preliminar y characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus, " Vet. Immunol. Immunopathol. 43:357 -371 (1994) ; G. C. Dulac and A. Afshar, "Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs, " Can. J. Vet. Res. 53:431 -433 (1989) ; S. Edwards and J. J. Sands, "Evidence of circovirus infection in British pigs, " Vet. Rec. 134:680 -1 (1994) ; J. C. Harding and E.G. Clark, "Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) , " Swine Health and Production 5:201 -203 (1997) ; R. K. Hines and P. D. Lukert, "Porcine circovirus: a serological survey of swine in the United States, " Swine Health and Production 3:71 -73 (1995) ; G. P. Nayar y col., "Evidence for circovirus in cattle with respirator y disease and from aborted bovine fetuses, " Can. Vet. J. 40:277 -278 (1999) ; I. Tischer y col., "Distribution of antibodies to porcine circovirus in swine populations of different breeding farms, " Arch. Virol. 140:737 -743 (1995) ; I. Tischer y col.,

"Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mice, and cattle, " Arch. Virol. 140:1427 1439 (1995) ) , se sabe poco con relación a la patogenia del PCV en estas especies animales. La infección experimental de cerdos con el PCV derivado de células PK-15 no produjo enfermedad clínica y, por tanto, este virus no se considera que sea patógeno para los cerdos (G. M. Allan y col., "Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material, " Vet. Microbiol. 44:49 64 (1995) ; I. Tischer y col., "Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus, " Arch. Virol. 91:271 276 (1986) ) . El PCV no patógeno derivado de la línea celular PK-15 contaminada se denominó circovirus porcino de tipo 1 o PCV1.

El síndrome de desmedro multisistémico posdestete (PMWS) , descubierto por primera vez en 1991 (J. C. Harding and E.G. Clark, 1997, citado anteriormente) , es una enfermedad compleja de los lechones de destete que está cada vez más extendida. Con la amenaza de un potencial impacto económico serio para la industria del cerdo, se hace urgente desarrollar una vacuna contra el PCV2, el principal agente causante del PMWS. El PMWS afecta directamente a cerdos de entre 5 y 18 semanas de edad. Los signos clínicos del PMWS incluyen pérdida de peso progresiva, disnea, taquipnea, anemia, diarrea, e ictericia. La tasa de mortalidad puede variar entre el 1 % y el 2 %, y llegar hasta el 40 % en algunos casos complicados en el Reino Unido (M. Muirhead, "Sources of information on PMWS/PDNS, " Vet. Rec. 150:456 (2002) ) . Las lesiones microscópicas características del PMWS incluyen neumonía intersticial granulomatosa, linfadenopatía, hepatitis y nefritis (G. M. Allan and J. A. Ellis, "Porcine circoviruses: a review, " J. Vet. Diagn. Invest. 12:3 -14 (2000) ; J. C. Harding and E.G. Clark, 1997, citado anteriormente) . El PMWS se ha reconocido actualmente en cerdos en Canadá, Estados Unidos (G. M. Allan y col., "Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes, " Vet. Rec. 142:467 -468 (1998) ; G. M. Allan y col., "Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe, " J. Vet. Diagn. Invest. 10:3 -10 (1998) ; G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, citado anteriormente; J. Ellis y col., "Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome, " Can. Vet. J. 39:44 -51 (1998) ; A. L. Hamel y col., "Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico quimérico del circovirus porcino (PCV1-2) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un PCV1 no patógeno que contiene un gen de la cápside del marco de lectura abierto inmunogénico ORF2 de un PCV2 patógeno en el lugar de la misma posición del gen de ORF en la molécula de ácido nucleico de PCV1, en la que el gen de ORF2 del PCV2 inmunogénico comprende una guanina en la posición del nucleótido 328 (mutación de C a G) y una citosina en la posición del nucleótido 573 (mutación A a C) .

2. La molécula de ácido nucleico quimérico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque las mutaciones se producen en la molécula de ácido nucleico quimérico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC Nº 2 o su cadena complementaria.

3. Un plásmido o vector viral caracterizado porque contiene la molécula de ácido nucleico quimérica de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Una célula huésped adecuada transfectada por el vector de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Un circovirus porcino quimérico producido a partir de la molécula de ácido nucleico quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

6. Un circovirus porcino quimérico producido por las células huésped de acuerdo con la reivindicación 4.

7. Un procedimiento de producción de un producto polipeptídico inmunogénico, estando dicho procedimiento caracterizado por cultivar, en condiciones de nutrientes adecuados, células huésped procariotas o eucariotas transfectadas con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 de una manera que permita la expresión de dicho producto polipeptídico y el aislamiento del producto polipeptídico deseado de la expresión de dicha molécula de ácido nucleico.

8. Un producto polipeptídico inmunogénico de la expresión de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Un polipéptido inmunogénico que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 4 o una variante biológicamente activa del mismo, que comprende las mutaciones P110A y R191S en la secuencia de aminoácidos.

10. Una vacuna viral que protege a un cerdo contra la infección viral o el síndrome de desmedro multisistémico posdestete (PMWS) causado por PCV2 caracterizado porque comprende un vehículo no tóxico, fisiológicamente aceptable y una cantidad inmunogénica de la molécula de ácido nucleico quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

11. Una vacuna viral que protege a un cerdo contra la infección viral o el síndrome de desmedro multisistémico posdestete (PMWS) causado por PCV2 caracterizado porque comprende un vehículo no tóxico, fisiológicamente aceptable y una cantidad inmunogénica del circovirus porcino quimérico de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6.

12. La vacuna viral de acuerdo con reivindicación 11, en la que la vacuna es una vacuna viva, una vacuna viva modificada, una vacuna inactivada, una vacuna de subunidad, una vacuna atenuada o una vacuna modificada por ingeniería genética.

13. Una vacuna viral que protege a un cerdo contra la infección viral o el síndrome de desmedro multisistémico posdestete (PMWS) causado por PCV2 caracterizado porque comprende un vehículo no tóxico, fisiológicamente aceptable y una cantidad inmunogénica del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9.

14. La vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 para su uso en un procedimiento de protección de un cerdo contra la infección viral o el síndrome de desmedro multisistémico posdestete (PMWS) causado por PCV2.

15. La vacuna para su uso en el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el procedimiento comprende la administración parenteral, intranasal, intradérmica o transdérmica de la vacuna al cerdo.

16. La vacuna para su uso en el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el procedimiento comprende la administración intralinfoide o intramuscular de la vacuna al cerdo.

17. Una molécula de ácido nucleico aislada de un gen de la cápside de ORF2 inmunogénico de PCV2 que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº 3 o su cadena complementaria, que comprende una mutación C a G en la posición del nucleótido 328 y una mutación A a C en la posición del nucleótido 573.