Polipéptidos del factor X de coagulación con propiedades de activación modificadas.

Una variante del factor X recombinante modificada biológicamente activa en la que una modificaciónconsiste en una inserción de un sitio de escisión adicional para una proteasa,

y en donde el sitio de escisiónadicional se inserta entre Ile235 y Val236 o entre Val236 y Gly237 o entre Gly237 y Gly238 en la cadena pesada delfactor X y en donde están excluidas deleciones en la secuencia del péptido de activación del factor X - de maneraque proteasas que activan de forma natural al factor X, ya no son capaces de escindir y activar dicha variante delfactor X.

Polipéptidos del factor X de coagulación con propiedades de activación modificadas Campo de la invención:

La presente invención se refiere a secuencias de ADNc modificadas que codifican polipéptidos del factor X, en particular el factor X humano y sus derivados que pueden evitar la necesidad del factor VIIIa/FIXa o del factor VIIa/FT para la activación, en donde una modificación consiste en una inserción de un sitio de escisión adicional para una proteasa, y en donde el sitio de escisión adicional se inserta entre Ile235 y Val236 o entre Val236 y Gly237 o entre Gly237 y Gly238 en la cadena pesada del factor X y en donde están excluidas deleciones en la secuencia del péptido de activación del factor X -de manera que proteasas, que activan de forma natural al factor X, ya no son capaces de escindir y activar dicha variante del factor X. La invención se refiere además a vectores de expresión recombinantes que contienen tales secuencias de ADNc modificadas, a células hospedadoras transformadas con tales vectores de expresión recombinantes, a polipéptidos recombinantes y a derivados que tienen actividades biológicas de la proteína de tipo silvestre sin modificar pero que tienen propiedades de activación alteradas y a procedimientos para la preparación de tales proteínas recombinantes y sus derivados. La invención también abarca un vector de transferencia para uso en una terapia génica humana, que comprende tales secuencias de ADN modificadas.

Antecedentes de la invención:

Las proteínas dependientes de la vitamina K se usan para tratar ciertos tipos de hemofilia. La hemofilia clásica o hemofilia A es un trastorno hemorrágico hereditario. Es el resultado de una deficiencia ligada al cromosoma X del factor VIII de la coagulación sanguínea, y afecta casi exclusivamente a varones con una incidencia de entre uno y dos individuos por cada 10.000. El defecto del cromosoma X es transmitido por las mujeres portadoras siendo ellas mismas no hemofílicas. La manifestación clínica de la hemofilia A es una tendencia a la hemorragia incrementada. Antes de la introducción del tratamiento con concentrados de factor VIII, el promedio de vida de una persona con hemofilia grave era menor a 20 años. El uso de concentrados de factor VIII procedente del plasma y más tarde de formas recombinantes del factor VIII, ha mejorado considerablemente la situación de los pacientes hemofílicos, incrementando mucho el promedio de vida, proporcionando a la mayoría de ellos la posibilidad de tener una vida más o menos normal. La hemofilia B que es 5 veces menos prevalente que la hemofilia A, está causada por un factor IX no funcional o ausente y se trata con concentrados de factor IX procedente del plasma o una forma recombinante del factor IX. Tanto en la hemofilia A como en la hemofilia B el problema médico más grave en el tratamiento de la enfermedad es la generación de aloanticuerpos contra los factores de sustitución. Hasta un 30% de todos los pacientes con hemofilia A desarrollan anticuerpos contra el factor VIII. Los anticuerpos contra FIX se producen en menor medida pero con consecuencias más graves, ya que son menos susceptibles a una terapia de inducción de tolerancia inmune.

El modelo actual de coagulación afirma que el desencadenante fisiológico de la coagulación es la formación de un complejo entre el factor tisular (FT) y el factor VIIa (FVIIa) en la superficie de células que expresan FT, que se encuentran normalmente fuera de la vasculatura y solo se vuelven accesibles cuando se produce una lesión. El complejo de factor VIIa/FT activa el factor IX y el factor X, generando en última instancia trombina. En un bucle de retroalimentación positiva, la trombina activa el factor VIII y el factor IX que luego también activan el factor X, el denominado brazo "intrínseco" de la cascada de coagulación sanguínea, amplificando de este modo la generación de factor Xa, que es necesario para la generación de la ráfaga de trombina completa para lograr una hemostasia completa. Se mostró que mediante la administración de concentraciones suprafisiológicas de FVIIa, se consigue una hemostasia evitando la necesidad de factor VIlla y factor IXa. La clonación del ADNc del factor VII (documento de patente de EE.UU. 4.784.950) hizo posible el desarrollo de un sustituto recombinante de ese factor de coagulación obtenido a partir del plasma. Este factor VIIa se administró con éxito por primera vez en 1988 a un paciente con un título elevado de anticuerpos inhibidores de FVIII. Desde entonces el número de indicaciones de factor VIIa ha crecido de manera constante lo que muestra un potencial para que el factor VIIa se convierta en un agente hemostático universal (Erhardtsen, 2002) . Desafortunadamente, el factor VIIa solo tiene una semivida en plasma de poco más de 2 horas y por lo tanto se tiene que volver a administrar con frecuencia, volviendo dicha terapia invasiva y muy costosa.

Existe, por ello una necesidad actual de factores de coagulación mejorados, especialmente de aquellos que son agentes hemostáticos de actividad correctora. Los agentes hemostáticos de actividad correctora son sustancias que permiten que se produzca la coagulación cuando se administran a pacientes en los que ciertos factores de coagulación están ausentes, no son funcionales o están bloqueados por anticuerpos inhibidores. La actividad de estos compuestos para corregir bloqueos en la cascada de la coagulación (actividad hemostática correctora) se puede medir mediante ensayos de coagulación conocidos en la técnica. Los agentes de actividad correctora esencialmente hemostáticos tienen la capacidad de activar los sustratos de un factor de coagulación ausente, no funcional o bloqueado, u otros sustratos en la cascada de la coagulación "aguas abajo" del factor de coagulación ausente, no funcional o bloqueado, de una forma directa de tal manera que el factor de coagulación ausente, no funcional o bloqueado ya no es necesario para la generación eficaz de trombina.

También el factor X ha sido objeto de una extensa investigación.

El ADNc del factor X se ha caracterizado (Leytus et al. 1984, PNAS, 82: 3699-3702) . El factor X de coagulación es una glicoproteína dependiente de la vitamina K con un peso molecular de 58, 5 kDa, que es secretada desde las células hepáticas en el plasma, como un zimógeno. Inicialmente, el factor X se produce como un prepropéptido con un péptido señal que consiste en un total de 488 aminoácidos. El péptido señal se separa por escisión con la peptidasa señal durante la exportación al retículo endoplasmático, la secuencia del propéptido se separa por escisión después de tener lugar la carboxilación gamma en los primeros 11 residuos del ácido glutámico en el extremo Nterminal de la cadena N-terminal madura. Una etapa de procesamiento adicional se produce mediante la escisión entre Arg182 y Ser183. Esta etapa del procesamiento también conduce de forma concomitante a la deleción del tripéptido Arg180-Lys181-Arg182. El zimógeno del factor X secretado resultante consta de una cadena ligera Nterminal de 139 aminoácidos (Mr 16.200) y una cadena pesada C-terminal de 306 aminoácidos (M, 42.000) que están ligadas covalentemente a través de un puente de disulfuro entre Cys172 y Cys342. Otras etapas de procesamiento posteriores a la traducción incluyen la β-hidroxilación de Asp103, así como la glicosilación de tipo N y O.

Tanto el factor VIlla/factor IXa o el factor VIIa/FT son capaces, en condiciones fisiológicas, de activar el factor X en las superficies de plaquetas activadas mediante la escisión carboxi-terminal a Arg234, liberando de este modo el denominado péptido de activación de 52 aminoácidos desde Ser183 a Arg234.

En una escisión autocatalítica, el factor X activado (factor Xa) separa por escisión un pequeño fragmento en el extremo C-terminal de su cadena pesada carboxi-terminal a Arg464, lo que conduce al factor Xaβ. Sin embargo, la relevancia fisiológica de esta escisión no está clara ya que ambas formas del factor Xa tienen actividades catalíticas comparables.

Se han realizado diversos intentos de modificar el factor X:

Wolf et al. 1991 (JBC, 266, nº 21, págs. 13726-13730) delecionaron el péptido de activación del factor X, sustituyéndolo con el dipéptido Arg-Lys que lleva a la introducción de 2 nuevos sitios de consenso de escisión de furina dentro de la región del péptido de activación del factor X. Tales variantes del factor X están activadas durante el procesamiento intracelular lo que conduce de este modo a la secreción de factor X activado.

Wolf et al. 1995 (Blood. 86. págs. 4153-4157) produjeron variantes inactivas aciladas del factor Xa, que se desacilan lentamente después de la inyección en el plasma sanguíneo... [Seguir leyendo]

1. Una variante del factor X recombinante modificada biológicamente activa en la que una modificación consiste en una inserción de un sitio de escisión adicional para una proteasa, y en donde el sitio de escisión adicional se inserta entre Ile235 y Val236 o entre Val236 y Gly237 o entre Gly237 y Gly238 en la cadena pesada del factor X y en donde están excluidas deleciones en la secuencia del péptido de activación del factor X -de manera que proteasas que activan de forma natural al factor X, ya no son capaces de escindir y activar dicha variante del factor X.

2. Una variante del factor X recombinante modificada biológicamente activa según la reivindicación 1, que se activa después de la escisión de dicho sitio de escisión adicional por dicha proteasa.

3. Una variante del factor X recombinante modificada biológicamente activa según la reivindicación 1 o 2, en la que dicha proteasa no activa de forma natural el factor X.

4. Una variante del factor X recombinante modificada biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el sitio de escisión insertado para una proteasa permite la activación de dicha variante modificada del factor X con una proteasa de serina.

5. Una variante del factor X recombinante modificada biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la secuencia de escisión insertada para una proteasa permite la activación de dicha variante del factor X modificada a través del factor IIa, factor IXa, factor Xa, factor XIa, factor XIIa, proteína C activada, elastasa o calicreína.

6. Una variante del factor X recombinante modificada biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el sitio de escisión insertado incluye al menos 3 aminoácidos.

7. Variante del factor X recombinante modificada biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha variante del factor X tiene una actividad hemostática correctora mejorada en comparación con variantes del factor X con una modificación dentro de la secuencia del péptido de escisión de activación del factor X presente en la naturaleza, representando dicha modificación un sitio de procesamiento de una proteasa que no escinde de forma natural en esta zona de la secuencia del factor X y que después de la escisión de dicho sitio de escisión adicional, activa dicha variante del factor X.

8. Un polinucleótido que codifica una variante del factor X recombinante biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un plásmido o un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 8.

10. Un plásmido o un vector según la reivindicación 9, que es un vector de expresión.

11. Un plásmido o un vector según la reivindicación 9, que es un vector de transferencia para uso en terapia génica humana.

12. Una célula hospedadora que comprende un polinucleótido según la reivindicación 9 o un plásmido o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

13. Un método para producir una variante del factor X recombinante biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende:

cultivar células hospedadoras según la reivindicación 12 en condiciones tales que la variante del factor X recombinante modificada se expresa; y

opcionalmente recuperar la variante del factor X recombinante modificada a partir de las células hospedadoras o del medio de cultivo.

14. Una composición farmacéutica que comprende una variante del factor X recombinante biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un polinucleótido según la reivindicación 8, o un plásmido o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

15. El uso de una variante del factor X recombinante biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, de un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 8, de un plásmido o de un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, o de una célula hospedadora según la reivindicación 13, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno de la coagulación sanguínea.

16. El uso según la reivindicación 15, en el que el trastorno de la coagulación sanguínea es hemofilia A.

17. El uso según la reivindicación 16, en el que la hemofilia A está causada o agravada por autoanticuerpos contra FVIII.

18. El uso según la reivindicación 15, en el que el trastorno de la coagulación sanguínea es hemofilia B.

19. El uso según la reivindicación 18, en el que la hemofilia B está causada o agravada por autoanticuerpos contra FIX.

20. El uso según la reivindicación 15, en el que el trastorno de la coagulación sanguínea es un déficit de FVII 5 y/o FVIIa.

21. El uso según la reivindicación 20, en el que el déficit de FVII y/o FVIIa está causado o agravado por autoanticuerpos contra FVII y/o FVIIa.

22. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en el que el tratamiento comprende una terapia génica humana.

23. El uso de una variante del factor X recombinante biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, de un polinucleótido según la reivindicación 8, de un plásmido o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, o de una célula hospedadora según la reivindicación 12, para la preparación de un medicamento con propiedades procoagulantes.