MÉTODO PARA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS Y VIRUS SIN MARCAJE BASADO EN TECNOLOGÍA DE DISCO COMPACTO.

La presente invención comprende una metodología de análisis rápido para la identificación y detección sin marcaje de virus y/o bacterias Gram + y Gram -,

resistentes o no a antibióticos, utilizando como soporte discos audio-video (CD, DVD, BD, Lightscribe, Superdisk, etc.) donde inmovilizar receptores moleculares específicos de biomoléculas presentes en la superficie de las bacterias y/o virus, empleando como detector un lector/grabador de discos (CD, DVD, BD, Lightscribe, etc.). La invención comprende tres procesos principales: resuspensión de virus y/o bacterias, incubación en el disco, y detección sin marcaje empleando un lector/grabador de discos compactos (CD, DVD, BD, etc.) La presente invención ha sido diseñada para identificar receptores o bioreceptores inmovilizados separados en la cara de policarbonato del disco y en posiciones conocidas y ordenadas, formando una micromatriz. Los bioreceptores específicos de biomoléculas presentes en la superficie de virus y/o bacterias pueden ser por ejemplo proteínas, lípidos y ácidos nucleicos.

SECTOR DE LA TECNICA

La presente invencion se centra en el sector de la biotecnologia, en concreto en el analisis para la identificacion y deteccion de bacterias y/o virus sin marcaje. Las principales aplicaciones de la invencion ocurren en la vigilancia epidemiologica, control de calidad de agua y aire, y en general cualquier area que implique la deteccion de bacterias mediante interacciones bioespecificas basadas en la utilizacion de receptores moleculares separados y ordenados sobre un soporte.

15 ESTADO DE LA TECNICA ANTERIOR

La tecnologia de deteccion y/o identificacion de bacterias y virus utilizando discos opticos como soportes, y lectores/grabadores de discos como detectores es conocida en el estado de la tecnica. ES2288429B2 (Universidad Politecnica de Valencia, 2006) describe un metodo de modificacion quimica de un disco compacto, destinado como soporte para la inmovilizacion covalente de biomoleculas, manteniendo al maximo las propiedades opticas y mecanicas del disco compacto. La inmovilizacion covalente de las biomoleculas se realiza en un orden y disposicion establecidos constituyendo un array o microarray sobre la superficie polimerica del disco compacto. Los enlaces covalentes del metodo descrito en ES2288429B2, en la mayoria de los casos son irreversibles. El enlace covalente es mas perdurable en el tiempo comparado con las interacciones electrostaticas asi como las interacciones hidrofilas/hidrofobas, permitiendo que el tipo de union de las biomoleculas a la superficie polimerica sea mas fuerte para resistir mejor los lavados. Las biomoleculas se encuentran marcadas para su deteccion directa o indirecta mediante la conjugacion con un fluorocromo o con una enzima. EP1324042A2 (Jose Reclame, 2001) describe un metodo para la deteccion y/o cuantificacion de moleculas ancladas a moleculas de captura que se encuentran fijadas en la superficie de un disco compacto mediante costosos y complicados medios. El metodo descrito permite realizar lecturas y/o detecciones biologicas en una cara del disco mientras que en la otra se pueden efectuar lecturas o grabaciones de las senales de fluorescencia obtenidas. ES2304093A1 (Universidad Politecnica de Valencia, 2006) describe un sistema integrado de almacenamiento de datos para analisis quimico de muestras y para deteccion y almacenamiento de los resultados analiticos. El sistema descrito es capaz de capturar los resultados analiticos obtenidos en una cara de un disco de almacenamiento de datos y obtener su transposicion en datos digitales para su posterior procesamiento y/o grabado en la otra cara del disco. El sistema comprende un disco compacto (CD/DVD) como soporte asi como un lector/grabador de CD/DVD para la deteccion de las senales de fluorescencia. Existe un creciente interes por los metodos de caracterizacion de moleculas mediante tecnicas sin marcaje 45 (label-free) . Habitualmente el proceso de deteccion o reconocimiento de moleculas se realiza mediante tecnicas que requieren elementos de marcado tales como colorantes fluorescentes, enzimas, isotopos radioactivos, etc. Sin embargo, los protocolos asociados al proceso de marcaje de estas moleculas para su deteccion implican mayor tiempo y mayor coste economico. Por ello se espera que los sistemas de deteccion e identificacion de moleculas sin marcado crezcan en importancia en sectores como el clinico, biofarmaceutico, medioambiental, seguridad, entre otros debido a su sencillez, sensibilidad, ahorro de reactivos y analitos, y en definitiva, menor coste por deteccion. US2007/0026382A1 (ALIX YALE & RISTAS LLP, 2006) describe un metodo alternativo a la citometria de flujo para deteccion de fenotipos y determinacion de respuestas funcionales en las celulas, basado en una 55 tecnologia sin marcaje, sobre una superficie biosensible, que puede ser un chip o una placa (biosensor chip) , de manera preferente recubierta de oro. La superficie biosensible descrita comprende un array de ligandos de captura especifica para marcadores de la superficie celular de manera que un fenotipo especifico se correlaciona con una localizacion de interaccion especifica sobre el chip. El tipo de celulas que se puede analizar incluye celulas animales, vegetales y bacterias. La lectura de la interaccion entre las celulas y los ligandos de captura especifica se realiza mediante una camara CCD o una camara CMOS. A pesar de los diferentes procedimientos descritos en el estado de la tecnica, actualmente existe la necesidad de desarrollar un metodo de analisis rapido sin marcaje para la identificacion y deteccion de bacterias y virus, basado en tecnologias de disco compacto.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invencion comprende una metodologia de analisis rapido para la identificacion y deteccion sin marcaje de virus y bacterias Gram + y Gram -, resistentes o no a antibioticos, utilizando como soporte discos audio-video (CD, DVD, BD, Lightscribe, Superdisk, etc.) donde inmovilizar receptores moleculares especificos de biomoleculas presentes en la superficie de las bacterias y/o virus, empleando como detector un lector/grabador de discos (CD, DVD, BD, Lightscribe, etc.) . La presente invencion ha sido disenada para identificar receptores o bioreceptores inmovilizados separados en la cara de policarbonato del disco y en posiciones conocidas y ordenadas, formando una micromatriz. Los bioreceptores especificos de biomoleculas presentes en la superficie de virus y/o bacterias pueden ser por ejemplo polisacaridos, proteinas, lipidos y acidos nucleicos.

Como realizacion preferente, la presente invencion se ha aplicado en la identificacion y deteccion sin marcaje de una suspension de neumococos (Strepcococcus pneumoniae) previamente aislada de una muestra clinica y crecida en medio solidos, asi como de una suspension de Escherichia coli y de Salmonella spp. Para ello, la invencion se ha disenado para identificar polisacaridos especificos presentes en la superficie de dichas bacterias, utilizando microarrays de antisueros.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

De manera general, el metodo de identificacion y/o deteccion de virus y/o bacterias objeto de la presente invencion comprende las siguientes etapas esenciales:

- resuspension de las bacterias y/o los virus contenidos en la muestra problema, 25 - incubacion en disco compacto, y

- deteccion sin marcaje empleando un lector/grabador de discos.

Resuspensión de las bacterias ylo los virus contenidos en la muestra problema Se parte de una muestra problema (a partir de ahora "muestra") ya obtenida, por ejemplo una muestra clinica, recogida por ejemplo en una placa tipo Petri y previamente incubada en un medio solido (por ejemplo en agar-sangre, agar chocolate, etc.) , durante un tiempo suficiente para que las bacterias y/o los virus alli contenidos crezcan en abundancia (100-105) sobre la superficie de la placa (por ejemplo 16-24 h) , hasta formar colonias.

Las muestras a analizar con la invencion pueden ser aislamientos microbianos de origen diverso como sangre (hemocultivo) , liquido pleural, liquido cefalorraquideo, saliva, esputo, orina, secrecion lacrimal, etc.

La resuspension del material de las colonias de bacterias y/o virus de la muestra se realiza por ejemplo mediante un asa de siembra de 1 IL que se pasa por la superficie del medio solido, para anadirse por ejemplo a un tubo de 1, 5 mL que contiene un volumen adecuado (por ejemplo entre 100-500 IL) de una disolucion acuosa tamponada (por ejemplo PBST, TBS-T, etc.) la cual se caracteriza por ser compatible con la suspension de bacterias y/o virus para su posterior incubacion en el disco.

Se obtiene una suspension de bacterias y/o virus que preferiblemente se homogeneiza antes del siguiente paso para eliminar posibles agregados y asi facilitar las interacciones con los receptores inmovilizados en la superficie del disco compacto.

Incubación en el disco compacto Se parte de un disco compacto (de ahora en adelante "disco") en cuya cara de policarbonato se han inmovilizado receptores moleculares localizados en la superficie de las bacterias y/o virus, quedando dispuestos en posiciones conocidas y ordenadas, formando una micromatriz. Estos receptores permiten identificar biomoleculas de la superficie del virus y/o la bacteria, tales como proteinas, lipidos, acidos 55 nucleicos, o polisacaridos.

A este paso se lo denomina impresion de micromatrices sobre el disco. La inmovilizacion de los receptores en el disco se puede realizar mediante diferentes metodos (Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques. 2th Edition. Academic Press, San Diego, CA. 2008) , de manera preferente pero no limitante, en una realizacion preferente de la presente invencion se realiza mediante la inmovilizacion de anticuerpos contenidos en antisueros mediante adsorcion en disco, tal y como se describe mas adelante.

1. Un método para identificar y/o detectar sin marcaje el tipo y/o grupo de al menos un virus y/o una bacteria previamente aislada e incubada en un medio sólido, caracterizado por comprender los siguientes pasos esenciales:

a) resuspender el virus y/o bacteria en una disolución acuosa tamponada seleccionada del grupo que consiste en PBST y TBS-T;

b) inmovilizar anticuerpos contenidos en un antisuero mediante adsorción en la cara de policarbonato de un disco compacto, formando una micromatriz en el disco; donde la inmovilización comprende los siguientes pasos: i) imprimir el disco con al menos una disolución del antisuero en presencia de un tampón de impresión que es una disolución acuosa de carbonato/bicarbonato 0, 1 M a pH 9, 5,

ii) incubar a 4 ºC durante un periodo de tiempo de al menos 16 horas,

iii) lavar con agua y secar el disco por centrifugación,

c) incubar la suspensión obtenida en el paso a) en el disco compacto obtenido en el paso b) ,

d) detectar el virus y/o bacteria en el disco compacto mediante la lectura del disco con un lector/grabador de discos compactos utilizando el láser del propio grabador como haz interrogante y el fotodiodo propio del cabezal pickup como elemento detector; y

e) determinar la concentración de virus y/o bacteria en función de la disminución de señal de reflexión obtenida en la etapa d) .

2. El método según la reivindicación 1 caracterizado por que antes o después del paso c)

comprende el siguiente paso adicional: f) teñir el virus y/o bacteria.

3. El método según las reivindicaciones 1-2, caracterizado por que la muestra se selecciona de entre el siguiente grupo: sangre, líquido pleural, líquido cefalorraquídeo, saliva, esputo, orina, y secreción lacrimal.

4. El método según las reivindicaciones 1-3, caracterizado por que la micromatriz del paso b) comprende entr.

50. 200 puntos que comprenden al menos un anticuerpo del virus y/o bacteria.

5. El método según la reivindicación 4, caracterizado por que los puntos tienen al menos entre 0, 30, 5 mm de diámetro y están separados al menos 1, 0 mm.

6. El método según las reivindicaciones 1-5, caracterizado por que el haz de luz del láser es absorbido y dispersado por al menos un precipitado producido por la interacción específica del anticuerpo con el virus y/o bacteria, disminuyendo la intensidad de la señal de reflexión que detecta el fotodiodo del cabezal pickup.

7. El método según la reivindicación 6, caracterizado por que la disminución de señal de reflexión se relaciona directamente con la interacción específica del anticuerpo con el virus y/o bacteria.

8. El método según las reivindicaciones 1-7, caracterizado por que la determinación del tipo y/o grupo del virus y/o bacteria definida en el paso e) se realiza visualmente con una plantilla que indica la localización del anticuerpo y de una tabla en la que se encuentran las diferentes combinaciones de señales positivas del anticuerpo, indicándose también a qué tipo y/o grupo de bacteria y/o virus corresponden dichas señales.

9. Un método para inmovilizar al menos un anticuerpo de al menos un virus y/o una bacteria, caracterizado por emplear como soporte un disco compacto, dicho método comprende los siguientes pasos:

i) imprimir la cara de policarbonato del disco con al menos una disolución de antisuero en presencia de un tampón de impresión que es una disolución acuosa de carbonato/bicarbonato 0, 1 M a pH 9, 5,

ii) incubar a 4 ºC durante un periodo de tiempo de al menos 16 horas, y iii) lavar con agua y secar el disco, donde se mantienen las propiedades ópticas y mecánicas del disco.

10. Un disco compacto caracterizado por comprender al menos un anticuerpo de al menos un virus y/o una bacteria, formando una micromatriz para ser leído por un lector/grabador de discos compactos.

11. Uso del disco definido en las reivindicaciones 10, para identificar y/o detectar sin marcaje el tipo y/o grupo de al menos un virus y/o una bacteria previamente aislada e incubada en un medio sólido.

12. Uso según la reivindicación 11, caracterizado por que la identificación y/o detección sin marcaje del tipo y/o grupo de al menos un virus y/o una bacteria es para vigilancia epidemiológica.

13. Uso según la reivindicación 11, caracterizado por que la identificación y/o detección sin marcaje 5 del tipo y/o grupo de al menos un virus y/o una bacteria es para control de calidad de agua y/o aire.

FIGURA. 1

FIGURA. 2 FIGURA. 3

FIGURA. 4