Un método para la detección de aneuploidías cromosómicas.

Un método para detectar la presencia de un trastorno cromosómico en el feto de una mujer embarazada,

quecomprende las etapas de:

(a) diferenciar alelos de ARN transcrito de al menos un locus genético de al menos un cromosoma de interésen una muestra biológica de la mujer embarazada que contiene ARN, en la que la muestra biológica quecontiene ARN contiene ARN fetal;

(b) determinar la relación del número de moléculas que contienen dichos alelos de los transcritos de ARN; y

(c) comparar 10 la relación de la etapa (b) con un control estándar que representa una relación de alelos demuestras biológicas comparables obtenidas de mujeres embarazadas que portan cada una un fetocromosómicamente normal, en donde un aumento o reducción de la relación con respecto al control estándarindica un riesgo aumentado de tener un feto con un trastorno cromosómico.

Un método para la detección de aneuploidías cromosómicas

Antecedentes de la invención [0001] La aneuploidía cromosómica es una causa importante de morbilidad durante la vida prenatal y postnatal. La evaluación de la aneuploidía cromosómica se ha asociado tradicionalmente con la investigación de la viabilidad fetal y diagnóstico prenatal. Los métodos para la detección y caracterización de aneuploidía cromosómica incluyen establecimiento de cariotipo de cromosomas en metafase, hibridación de fluorescencia in situ (FISH) (Homer, J. et al., Prenat Diagn 23:566-571 (2003) ) , reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con fluorescencia cuantitativa (Mann, K. Methods Mol Med 92:141-156 (2004) ) , PCR de dosificación génica (Zimmermann, B. et al., Clin Chem 48:362-363 (2002) , hibridación genómica comparativa basada en matrices (CGH) (Hu, D.G. et al., Mol Hum Reprod (2004) ) .

Se sabe que la aneuploidía cromosómica fetal contribuye significativamente a pérdida fetal y representa 50% de los abortos espontáneos del primer trimestre (Chitty, 54:839 L. Br Med Bull-856 (1998) ) . Los fetos viables están asociados especialmente con ciertos tipos de aneuploidía cromosómica. La trisomía del 21, o síndrome de Down, es la aneuploidía autosómica más común compatible con supervivencia postnatal con una incidencia de 1 de cada 800 nacimientos vivos (Hook, E. B. Lancet 2:169-172 (1981) ) . La trisomía del 21 es la razón más habitual por la que las parejas optan por el diagnóstico prenatal. En la actualidad, el diagnóstico definitivo de un feto con trisomía del 21 y otras aneuploidías cromosómicas se basa en el análisis genético de material genético fetal obtenido por procedimientos invasivos tales como amniocentesis y toma de muestras de la vellosidad del corion (CVS) . Debido a su naturaleza invasiva, estos procedimientos están asociados con un riesgo limitado de aborto espontáneo. Por lo tanto, se han desarrollado otros enfoques no invasivos para estratificar los embarazos de acuerdo con el riesgo de portar un feto con trisomía del 21. Solo se recomienda que se sometan a los procedimientos invasivos embarazos con un riesgo sustancial, definido como un riesgo mayor que el riesgo de pérdida fetal relacionado con el procedimiento. Las estrategias de estratificación del riesgo que se usan en la actualidad incluyen la evaluación de la edad materna, marcadores bioquímicos en suero materno y elementos de ultrasonido fetal (Nicolaides, K. H. et al., Prenat Diagn 22:308-315 (2002) ) .

Para conseguir una mejor sensibilidad y especificidad, se han evaluado diversas combinaciones de marcadores y enfoques (Wald, N. J. et al., Prenat Diagn 17:821-829 (1997) ) , incluyendo el ensayo triple, ensayo cuádruple (Wald, N. J. et al., Lancet 361:835-836 (2003) ) , ensayo integrado (Wald, N. J. et al., N Engl J Med

341:461-467 (1999) ) y exploración de primer trimestre (Wapner, R. et al., N Engl J Med 349:1405-1413 (2003) ) . Los marcadores bioquímicos de suero en uso incluyen alfa-fetoproteína, estriol no conjugado, gonadotropina coriónica humana beta libre o total, inhibina-A y proteína A de plasma asociada con el embarazo (PAPP-A) . Los embarazos cuyo riesgo se ha mostrado que es alto por estas modalidades de exploración se remiten en última instancia a amniocentesis o CVS.

Recientemente, el descubrimiento de ácidos nucleicos fetales sin células en circulación en el plasma materno ha proporcionado una fuente alternativa de material genético fetal del que pueden tomarse muestras de forma no invasiva (Lo, Y. M. D. et al., Lancet 350:485-487 (1997) ; Poon, L. L. M. et al., Clin Chem 46:1832-834 (2000) ) . Además, se ha mostrado que las concentraciones de ADN fetal en circulación en el plasma de mujeres que 45 portan fetos con trisomía del 21 son significativamente mayores que las de mujeres que portan fetos euploides (Lo,

Y. M. D. et al., Clin Chem 45:1747-1751 (1999) ; Zhong, X. Y. et al., Prenat Diagn 20:795-798 (2000) ) . Recientemente, también se ha mostrado que el ARN fetal en circulación es prometedor como una clase de marcador de ácido nucleico fetal independiente del sexo en el plasma materno. (Ng, E. K. O. et al., Clin Chem 49:727-731 (2003) ; Ng, E. K. O. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 100:4748-4753 (2003) ) . Por lo tanto, la cuantificación de ácido nucleico fetal en circulación es útil como un marcador de exploración prenatal adicional para la estratificación de los embarazos por riesgo.

Se ha mostrado que los transcritos de ARNm expresados en placenta, tales como los que codifican el lactógeno placentario humano (hPL) , subunidad beta de gonadotropina coriónica humana (!hCG) (Ng, E. K. O. et al.,

Clin Chem 49:727-731 (2003) ) , hormona liberadora de corticotropina (CRH) (Ng, E. K. O. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 100:4748 -4753 (2003b) ) , inhibidor de la ruta de factor tisular 2 (TFPI2) , supresor de metástasis KiSS-1 (KISS1) y específico de placenta 1 (PLAC1) (Tsui, N. B. Y. et al. J Med Genet 41:461-7 (2004) ) , son detectables en plasma materno. Se sabe que estas especies de ARNm derivado de placenta son específicos del embarazo (Ng, E. K. O. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 100:4748-4753. 2003) ; Tsui, N. B. Y. et al., J Med Genet 41:461-7 (2004) ) . En particular, se han presentado aumentos aberrantes de concentraciones de ARNm de CRH en plasma materno en embarazos con preeclampsia (Ng, E. K. O. et al., Clin Chem 49:727-731 (2003) ) . Ya que estos marcadores expresados en placenta son específicos de embarazo pero independientes de sexo y polimorfismo, son útiles en la evaluación prenatal no invasiva de todos los embarazos.

La aneuploidía cromosómica altera la dosificación de genes localizados en el cromosoma aneuploide. La dosificación génica alterada puede reflejarse en una relación de alelos distorsionada de los genes. La relación de alelos distorsionada se ve a su vez reflejada por una relación de alelos distorsionada de polimorfismos presentes en el transcrito de ARN de los loci genéticos en el cromosoma aneuploide. Un ejemplo de tales polimorfismos es el polimorfismo de un único nucleótido (SNP) en el que la relación de los alelos de SNP puede distorsionarse en presencia de aneuploidía del cromosoma en cuestión. Por lo tanto, se establece un intervalo de referencia para la relación de ARN-SNP para embarazos normales y puede determinarse la trisomía del 21 fetal cuando se observa una desviación de la relación de referencia. En comparación con métodos citogenéticos convencionales de análisis, la técnica propuesta no requiere cultivo previo de las células fetales y por lo tanto acorta el tiempo analítico. Además, pueden obtenerse muestras de sangre materna de forma no invasiva, minimizando de este modo el daño potencial tanto al feto como a la madre.

Descripción resumida de la invención [0007] En una realización, la presente invención proporciona un método mejorado para detectar la presencia de un trastorno cromosómico en el feto de una mujer embarazada usando la relación de alelos de moléculas de transcritos de ARN del feto de la mujer embarazada en comparación con la relación hallada en mujeres embarazadas con un feto cromosómicamente normal. El uso de la relación de esta manera proporciona sensibilidad superior en la detección de trastornos cromosómicos fetales, especialmente cuando se comparan con la mera cuantificación de la cantidad de un alelo particular o la concentración total de un transcrito de ARN particular presente.

La primera etapa del método implica determinar la relación de alelos de los transcritos de ARN en el feto de una mujer embarazada. Esto se consigue obteniendo una muestra biológica que contiene ARN de la mujer embarazada, en la que la muestra biológica que contiene ARN contiene ARN fetal. Los alelos se diferencian después del ARN transcrito de al menos un locus genético de al menos un cromosoma de interés, seguido de la determinación de la relación de los alelos de los transcritos de ARN. La segunda etapa implica comparar la relación de la mujer embarazada con un control convencional que representa una relación media de alelos de muestras biológicas comparables obtenidas de mujeres embarazadas que portan cada una un feto cromosómicamente normal, en las que un aumento o reducción en la relación del control convencional indica un mayor riesgo de tener un feto con un trastorno cromosómico.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método en el que el trastorno cromosómico es un miembro seleccionado del grupo que consiste en trisomía de 21, trisomía del 18 y trisomía del 13. En otras realizaciones, el trastorno cromosómico es trisomía del 21. En otra realización, el trastorno cromosómico es trisomía del 13. En una realización... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar la presencia de un trastorno cromosómico en el feto de una mujer embarazada, que comprende las etapas de: 5

(a) diferenciar alelos de ARN transcrito de al menos un locus genético de al menos un cromosoma de interés en una muestra biológica de la mujer embarazada que contiene ARN, en la que la muestra biológica que contiene ARN contiene ARN fetal;

(b) determinar la relación del número de moléculas que contienen dichos alelos de los transcritos de ARN; y

(c) comparar la relación de la etapa (b) con un control estándar que representa una relación de alelos de muestras biológicas comparables obtenidas de mujeres embarazadas que portan cada una un feto cromosómicamente normal, en donde un aumento o reducción de la relación con respecto al control estándar indica un riesgo aumentado de tener un feto con un trastorno cromosómico.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el trastorno cromosómico es un miembro seleccionado del grupo que consiste en trisomía 21, trisomía 18 y trisomía 13.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el trastorno cromosómico está en el cromosoma X o en el cromosoma Y.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica en la etapa (a) es un miembro seleccionado del grupo que consiste en sangre materna, plasma o suero materno, líquido amniótico, muestra de la vellosidad del corion, células nucleadas fetales o residuos celulares fetales aislados de sangre materna, orina materna, saliva materna, lavados del tracto reproductivo femenino y una muestra obtenida por celocentesis.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica en la etapa (a) es sangre materna o contiene elementos celulares o residuos celulares en la sangre materna.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el ARN fetal en la etapa (a) deriva de la placenta.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (a) se lleva a cabo usando una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) .

8. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (a) y/o la etapa (b) se realiza usando un miembro

seleccionado del grupo que consiste en una reacción de extensión de cebadores, espectrometría de masas, hibridación usando al menos una sonda, hibridación usando al menos una sonda marcada con fluorescencia, secuenciación directa, clonación y secuenciación y electroforesis.

9. El método de la reivindicación 1, en el que los alelos en las etapas (a) , (b) y (c) se diferencian por variación de secuencia.

10. El método de la reivindicación 11, en el que la variación de secuencia es un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) , un polimorfismo de inserción/deleción o un polimorfismo de repetición en tándem sencilla.

11. El método de la reivindicación 1, en el que el ARN se transcribe de un miembro seleccionado del grupo que consiste en cromosoma 21, cromosoma 18, cromosoma 13, cromosoma X, y cromosoma Y.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el ARN se transcribe del cromosoma 21.

13. El método de la reivindicación 1, en el que el ARN es ARNm.

14. El método de la reivindicación 1, en el que el ARN se transcribe de al menos un locus genético seleccionado del grupo que consiste en colágeno VI alfa 1 (COL6A1) , superóxido dismutasa 1 (SOD1) , colágeno VI alfa 2 (COL6A2) , subunidad O de la ATP sintasa mitocondrial (ATP50) , familia BTG, miembro 3 (BTG 3) , uno similar a desintegrina y

metaloproteasa (tipo reprolisina) con un motivo de trombospondina tipo 1, 1 (ADAMFS1) , enzima de escisión de APP 2 por sitio beta (BACE2) , intersectina 1 (ITSN1) , proteína precursora del beta amiloide (A4) (APP) , ATP sintasa, transportador de H+, complejo FO mitocondrial, subunidad F6 (ATP5J) , gen 5 de la región crítica del síndrome de Down (DSCR5) , específico de placenta 4 (PLAC4) , proteína hipotética BC005107 (LOC90625) , proteína ribosómica L17 (RPL17) , miembro 2 inhibidor de serpina peptidasa clado B (ovoalbúmina) (SERPINB2) y colágeno tipo IV alfa 2 (COL4A2) .

15. El método de la reivindicación 14, en el que el ARN contiene al menos un polimorfismo de un único nucleótido del locus genético.

16. El método de la reivindicación 14, en el que el ARN se transcribe de al menos un locus genético seleccionado del grupo que consiste en colágeno VI alfa 1 (COL6A1) y colágeno VI alfa 2 (COL6A2) .

17. El método de la reivindicación 16, en el que el ARN transcrito del locus genético del SNP de COL6A1 es Arg850His o Ser932Ser. 5

18. El método de la reivindicación 16, en el que el ARN transcrito del locus genético del SNP de COL6A2 es Val728Val.

19. El método de la reivindicación 14, en el que el ARN se transcribe del locus genético para específico de placenta 4 (PLAC4) .

20. El método de la reivindicación 19, en el que el ARN se transcribe de cualquier variante del gen PLAC4 tal como AF269287, AK027868, AK092431, BC093685, BC101615, BC101617, L13197, NM_182832 y LOC191585.

21. El método de la reivindicación 19, en el que el ARN transcrito del locus genético del gen PLAC4 contiene un polimorfismo de un único nucleótido o un polimorfismo de inserción-deleción seleccionado del grupo que consiste en rs3804026, rs4818219, rs7844, rs9015, rs13643, rs9305729, rs9305730, rs5019195, rs5019194, rs5844069, rs1049904, rs16998089, rs12482116, rs11909439, rs7278659, rs12106409, rs12106395, rs12106401, rs12106434, rs2183584, rs3949725, rs8130833, rs10222145, rs9981478, rs8130833, rs9977003, PLAC4-41471145 y PLAC441476236.

22. El método de la reivindicación 1, en el que la mujer está en el primer, segundo o tercer trimestre de gestación.

23. El método de la reivindicación 1, en el que la comparación en la etapa (c) muestra un riesgo aumentado de que

el feto tenga un trastorno cromosómico si la relación en la etapa (b) es mayor o menor en 1, 2 ó 3 desviaciones estándar que el control estándar.

24. El método de la reivindicación 1, en el que la comparación en la etapa (c) muestra un riesgo aumentado de que el feto tenga un trastorno cromosómico si la relación en la etapa (b) es mayor o menor en 2 desviaciones estándar que el control estándar.

25. El método de la reivindicación 1, en el que la comparación en la etapa (c) muestra un riesgo aumentado de que el feto tenga un trastorno cromosómico si la relación en la etapa (b) es mayor o menor en 3 desviaciones estándar que el control estándar.

26. Un kit para detectar la presencia de un feto con un trastorno cromosómico en una mujer embarazada, comprendiendo el kit:

(a) cebadores para amplificar una secuencia de nucleótidos originada de una especie de ARN transcrita a partir de un locus de interés seleccionado del grupo que consiste en colágeno VI alfa 1 (COL6A1) , superóxido dismutasa 1 (SOD1) , colágeno VI alfa 2 (COL6A2) , subunidad O de la ATP sintasa mitocondrial (ATP5O) , familia BTG, miembro 3 (BTG 3) , similar a desintegrina y metaloproteasa (tipo reprolisina) con un motivo de trombospondina de tipo 1, 1 (ADAMTS1) , enzima de escisión de APP 2 por sitio beta (BACE2) , intersectina 1 (ITSN1) , proteína precursora del beta amiloide (A4) (APP) , ATP-sintasa, transportador de H+, complejo F0

mitocondrial, , subunidad F6 (ATP5J) , gen 5 de la región crítica del síndrome de Down (DSCR5) , específico de placenta 4 (PLAC4) , proteína hipotética BC005107 (LOC90625) , proteína ribosómica L17 (RPL17) , miembro 2 inhibidor de serpina peptidasa clado B (ovoalbúmina) (SERPINB2) y colágeno de tipo IV alfa 2 (COL4A2) , en el que al menos un cebador para la amplificación de una secuencia de nucleótidos que codifica un transcrito anteriormente nombrado es específico de secuencia para el locus; y

(b) un control estándar que contiene una relación conocida de alelos transcritos de dicho locus que refleja la relación de dichos alelos en mujeres embarazadas que portan cada una un feto cromosómicamente normal.

27. El kit de la reivindicación 26, que comprende además:

(c) sondas de hibridación para diferenciar entre los diferentes alelos de cada especie de ARN.

28. El kit de acuerdo con la reivindicación 26, en el que el control estándar es una solución que contiene ARN que codifica colágeno VI alfa 1 (COL6A1) , superóxido dismutasa 1 (SOD1) , colágeno VI alfa 2 (COL6A2) , subunidad O de la ATP sintasa mitocondrial (ATP50) , familia BTG, miembro 3 (BTG 3) , similar a desintegrina y metaloproteasa (tipo reprolisina) con un motivo trombospondina de tipo 1, 1 (ADAMTS1) , enzima de escisión de APP 2 por sitio beta (BACE2) , intersectina 1 (ITSN1) , proteína precursora del beta amiloide (A4) (APP) , ATP-sintasa, transportador de H+, complejo F0 mitocondrial, subunidad F6 (ATP5J) , gen 5 de la región crítica del síndrome de Down (DSCR5) , específico de placenta 4 (PLAC4) , proteína hipotética BC005107 (LOC90625) , proteína ribosómica L17 (RPL17) , miembro 2 inhibidor de serpina peptidasa clado B (ovoalbúmina) (SERPINB2) o colágeno de tipo IV alfa 2 (COL4A2) ,

con una relación de la media establecida de la misma especie que se ensamblan artificialmente.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción Literatura diferente de patentes citadas en la descripción