Citómetro de flujo con un sistema de alienación óptica automatizado activo.

Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo, que comprende:

a. un objetivo (22);

b. una fuente de emisión de radiación electromagnética (12) para la emisión de un rayo de radiaciónelectromagnética;

c. al menos un elemento óptico (24) para el control de la dirección del rayo de radiación electromagnética;

d. un detector de la dirección del rayo de radiación electromagnética (28, 43) que tiene una superficielocalizada para recibir una parte de dicho rayo de radiación electromagnética, donde la incidencia de dichaparte de dicho rayo de radiación electromagnética sobre dicha superficie genera una señal de posición del rayode radiación electromagnética (30, 44);

donde dicha señal de posición del rayo de radiación electromagnética se analiza mediante un sistema decontrol (45) que genera una señal de corrección de la dirección del rayo de radiación electromagnética (46);

e. un dispositivo de control de posición (23) acoplado a dicho al menos un elemento óptico, donde dichodispositivo de control de posición responde a dicha señal de corrección de la dirección del rayo de radiaciónelectromagnética (46) para controlar direccionalmente dicho elemento óptico (24) para alinear dicho rayo deradiación electromagnética con dicho objetivo.

Citómetro de flujo con un sistema de alineación óptica automatizado activo

I. Campo técnico Un sistema automatizado de monitorización y alineación para posicionar los componentes mecánicos y ópticos de un citómetro de flujo para mejorar la consistencia, rendimiento, y eficacia de la clasificación de partículas y de las aplicaciones de análisis.

II. Antecedentes La citometría de flujo proporciona un método para analizar y diferenciar partículas que se aplica a diversas aplicaciones clínicas y de investigación. Generalmente, los sistemas de citómetro de flujo irradian partículas y a continuación detectan la radiación emitida por la partícula para identificar un atributo o atributos físicos particulares de la partícula o partículas individuales que se están estudiando. En las aplicaciones de clasificación de partículas, cada partícula se puede separar de la población principal en base a los atributos físicos identificados como se divulga, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos con números 5.643.796; 5.602.349; y 5.602.039; y en la Solicitud de Patente Internacional Nº PCT/US95/13308.

Durante la operación de los citómetros de flujo, un enfoque hidrodinámico arrastra partículas en una corriente de fluido de modo que se pueden introducir individualmente en un área objetivo o área de análisis. Se puede inducir que la corriente de fluido forme gotitas para posteriormente ayudar en la separación de partículas individuales. Típicamente, los citómetros de flujo usan una fuente de emisión de radiación electromagnética tal como un láser

para generar un rayo de radiación electromagnética que se puede controlar direccionalmente para interceptar el área objetivo. La radiación de una partícula objetivo que pasa a través del área objetivo, tal como una célula, puede dar lugar a una emisión de dispersión o fluorescencia que se puede controlar direccionalmente a un receptor que genera una señal que se puede analizar para diferenciar las partículas.

Un problema importante con los sistemas de citómetro de flujo convencionales puede ser que el análisis preciso de tal emisión de difusión o fluorescencia requiere que el área objetivo permanezca alineada de forma precisa con el rayo de radiación electromagnética y que la emisión de dispersión o fluorescencia de la irradiación del objetivo permanezca alineada de forma precisa con el detector. Sin embargo, la posición de los diversos componentes de un citómetro de flujo cambia en respuesta a pequeñas fluctuaciones en el ambiente externo, que incluyen, pero no se limitan a, pequeñas fluctuaciones en la temperatura, presión, y fuerzas mecánicas, así como pequeñas fluctuaciones en el entorno interno, que incluyen, pero no se limitan a, deriva electrónica, frecuencia o amplitud de la radiación, o similares. Las fluctuaciones pueden ocurrir durante la preparación del instrumento o durante la operación de rutina del instrumento provocando una diversidad de problemas.

En primer lugar, el periodo de tiempo que un operador dedica a alinear un citómetro de flujo al comienzo de un período operación o durante la operación de rutina del citómetro de flujo puede ser considerable. Esto puede significar una parte importante del tiempo programado del operador en el instrumento y puede abreviar o incluso impedir cualquier esfuerzo real de análisis.

En segundo lugar, la monitorización de la alineación durante largos períodos de tiempo, tal vez horas, puede ser difícil a simple vista. Incluso las más pequeñas variaciones en la alineación pueden traducirse en señales inútiles en el detector o dar como resultado un aumento de la contaminación de las poblaciones de partículas clasificadas. La corrección de la alineación sobre la marcha por parte del operador del citómetro de flujo puede no ser fiable dado que los datos disponibles por el operador pueden dar como resultado estimaciones subjetivas de la verdadera alineación.

En tercer lugar, la inconsistencia de alineación a alineación puede impedir satisfactoriamente la calibración de los citómetros de flujo con respecto a partículas de calibración estandarizadas. Con frecuencia se usan parámetros del instrumento distintos de la alineación para calibrar el instrumento una vez que el operador optimiza subjetivamente la 55 alineación óptica. Los que estén familiarizados con la citometría de flujo pueden ser conscientes de que una calibración del instrumento realizada de esta manera puede conducir a una amplia y a veces inaceptable variación en los resultados de operación, incluso durante las aplicaciones de rutina.

En cuarto lugar, debido a que los sistemas de citómetro de flujo convencionales no tienen el equipamiento de monitorización de la alineación necesario para determinar si un sistema de citometría de flujo está alineado, está ligeramente fuera de alineación y requiere de un ajuste, o si el sistema está catastróficamente desalineado, puede ser difícil permitir que un sistema de citómetro de flujo convencional opere sin ser atendido por un operador.

Se han hecho diversos intentos para montar físicamente todos los componentes ópticos en sistemas convencionales 65 de citómetro de flujo para que aborden estas preocupaciones. Desafortunadamente, tales sistemas de citómetro de flujo todavía pueden ser propensos a la deriva mecánica y de temperatura y necesitan regularmente un servicio de mantenimiento para la recalibración de la alineación. Además, los componentes ópticos montados físicamente pueden estar disponibles solo con respecto a ciertos sistemas de citómetro de flujo basados en cubeta.

En lo que se refiere al campo de la citometría de flujo y al deseo general de automatizar y monitorizar la alineación 5 mecánica y óptica de los sistemas de citometría de flujo, la presente invención divulga técnicas que superan virtualmente cada uno de estos problemas de un modo práctico.

Tal vez de manera sorprendente, esto satisface la necesidad percibida desde hace tiempo de conseguir métodos de alta velocidad, precisión y económicos para el posicionamiento automatizado de los componentes dentro del

citómetro de flujo. Hasta cierto punto, incluso los que están implicados en la fabricación de citómetros de flujo no apreciarían que los problemas de monitorización y control direccional para la alineación de un sistema de citómetro de flujo se podrían solucionar utilizando los diversos componentes que se divulgan en la presente invención.

La patente de Estados Unidos US4318481 describe un aparato automático para cargar sincronizadamente gotitas en un sistema de clasificación de flujo electrostático. La posición en la que se perturba el flujo laminar de modo que forme las gotitas se monitoriza usando una fuente de luz y un detector. La patente de Estados Unidos US4498766 divulga un aparato de citometría de flujo que tiene una lente de enfoque de un rayo que se rota de modo que produzca una mancha elíptica del rayo alargando de esa manera la mancha focal del rayo. En el documento WO98/34094, se divulgan diversas disposiciones de prisma para controlar la geometría del rayo.

III. Divulgación de la invención La presente invención incluye una diversidad de aspectos que se pueden seleccionar en diferentes combinaciones en base a la aplicación o a las necesidades particulares a las que se dirige. En una realización básica, la presente invención divulga un sistema de control de alineación y monitorización que usa detección posicional, direccional, o de imagen para controlar la alineación de diversos componentes de un citómetro de flujo.

Un objetivo general adicional de las realizaciones particulares de la presente invención puede ser permitir la monitorización de la alineación durante la operación de rutina de un citómetro de flujo. En consonancia con este objetivo, una meta puede ser proporcionar una imagen óptica de la región objetivo del citómetro de flujo para permitir una determinación muy precisa de esta posición, y de la de las fuentes de radiación electromagnética, tales como láseres.

Otro objetivo de las realizaciones particulares de la presente invención puede ser permitir la alineación durante la operación normal de citometría de flujo, que incluye pero no se limita al procesamiento de partículas. En consonancia con este objetivo, una meta es utilizar un esquema de control que se pueda emplear sin interferir con el procesamiento del citómetro de flujo para proporcionar un nivel muy preciso de la precisión de alineación.

Un objetivo adicional de las realizaciones particulares de la presente invención puede ser permitir la monitorización sin afectar la calidad de las medidas realizadas por el sistema de citómetro... [Seguir leyendo]

1. Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo, que comprende:

a. un objetivo (22) ;

b. una fuente de emisión de radiación electromagnética (12) para la emisión de un rayo de radiación electromagnética;

c. al menos un elemento óptico (24) para el control de la dirección del rayo de radiación electromagnética;

d. un detector de la dirección del rayo de radiación electromagnética (28, 43) que tiene una superficie

localizada para recibir una parte de dicho rayo de radiación electromagnética, donde la incidencia de dicha parte de dicho rayo de radiación electromagnética sobre dicha superficie genera una señal de posición del rayo de radiación electromagnética (30, 44) ; donde dicha señal de posición del rayo de radiación electromagnética se analiza mediante un sistema de control (45) que genera una señal de corrección de la dirección del rayo de radiación electromagnética (46) ;

e. un dispositivo de control de posición (23) acoplado a dicho al menos un elemento óptico, donde dicho dispositivo de control de posición responde a dicha señal de corrección de la dirección del rayo de radiación electromagnética (46) para controlar direccionalmente dicho elemento óptico (24) para alinear dicho rayo de radiación electromagnética con dicho objetivo.

2. Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 1, donde dicho detector de la dirección del rayo de radiación electromagnética (28) muestrea una parte de dicho rayo de radiación electromagnética en una posición entre dicho al menos un elemento óptico y dicho objetivo.

3. Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 1, donde dicho detector de la dirección del rayo de radiación electromagnética (43) muestrea una parte de dicho rayo de radiación electromagnética después de la incidencia de dicho rayo de radiación electromagnética sobre dicho objetivo.

4. Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo como se describe en las reivindicaciones 2 o 3, donde dicho detector de la dirección del rayo de radiación electromagnética comprende un detector de fotodiodo de cuadrante. 30

5. Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una corriente de fluido, donde dicho objetivo (22) comprende una posición en dicha corriente de fluido, y donde dicho rayo de radiación electromagnética se alinea con dicha posición en dicha corriente de fluido.

6. Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 5, que comprende adicionalmente partículas arrastradas en dicha corriente de fluido, donde dicho rayo de radiación electromagnética alineado con dicha posición en dicha corriente de fluido irradia al menos una de dichas partículas arrastradas en dicha corriente de fluido.

7. Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una boquilla (48) que tiene una abertura de boquilla, donde dicha corriente de fluido sale a través de dicha abertura de boquilla.

8. Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 7, que comprende 45 adicionalmente:

a. un segundo elemento óptico al que dicho rayo de radiación electromagnética emitido desde dicha fuente de emisión de radiación electromagnética responde direccionalmente;

b. un segundo detector de la dirección del rayo de radiación electromagnética que tiene una superficie

posicionada para recibir una parte de dicho rayo de radiación electromagnética, donde la incidencia de dicha porción de dicho rayo de radiación electromagnética sobre dicha superficie genera una señal de corrección de dirección del rayo de radiación electromagnética; y

c. un segundo dispositivo de control de posición acoplado a la dicho segundo elemento óptico, donde dicho segundo dispositivo de control de posición responde a dicha señal de corrección de dirección del rayo de 55 radiación electromagnética para alinear automáticamente dicho rayo de radiación electromagnética sobre dicho objetivo.

9. Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 7, donde el detector de la dirección del rayo de radiación electromagnética muestrea una parte de dicho rayo de radiación electromagnética 60 en una posición entre dicho al menos un elemento óptico y dicho objetivo.

10. Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 1, donde dicho detector de la dirección del rayo de radiación electromagnética muestrea una parte de dicho rayo de radiación electromagnética después de la incidencia de dicho rayo de radiación electromagnética sobre dicho objetivo.

11. Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 1, que comprende adicionalmente:

a. un elemento de polarización de radiación electromagnética (40) ;

b. un rayo de radiación electromagnética emitido desde dicho objetivo coaxial a dicha ruta de excitación que responde a dicho elemento de polarización de radiación electromagnética;

c. un elemento reflectante sensible a la polarización (41) que refleja dicho rayo de radiación electromagnética emitido desde dicho objetivo polarizado por dicho elemento de polarización de radiación electromagnética; y

d. un dispositivo de captura de representación de imagen (52) que responde a dicha radiación electromagnética emitida desde dicho objetivo polarizada por dicho elemento de polarización de radiación electromagnética.

12. Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 6, que comprende adicionalmente:

a. un elemento de iluminación (47) posicionado para proporcionar la iluminación de dicha corriente de fluido;

b. una pantalla de imagen (33) incidente a la emisión de radiación electromagnética generada por dicha partícula y dicha iluminación de dicha corriente de fluido;

c. una imagen generada en dicha pantalla de imagen de dicha emisión de radiación electromagnética generada por dicha partícula y dicha iluminación de dicha corriente de fluido;

d. al menos una abertura de la pantalla de imagen (34) a través de la cual pasa al menos parte de dicha emisión de radiación electromagnética generada por dicha partícula;

e. un receptor (14) incidente a dicha al menos parte de dicha emisión de radiación electromagnética generada por dicha partícula; y

f. un dispositivo de captura de representación de imagen (31) que responde a dicha imagen generada en dicha

pantalla de imagen, donde dicho dispositivo de captura de representación de imagen genera una señal de posición del rayo de radiación electromagnética.

13. Un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 1, que comprende adicionalmente:

a. al menos un elemento de almacenamiento de memoria que responde a dicha señal de posición del rayo de radiación electromagnética;

b. un elemento de recuperación para recuperar dicha señal de posición del rayo electromagnético a partir de

dicho al menos un elemento de almacenamiento de memoria; 35 c. un elemento de análisis de la señal de posición del rayo electromagnético; y

d. un controlador que proporciona la señal de corrección de la posición del rayo de radiación electromagnética para posicionar los dispositivos de control acoplados a dicho al menos un elemento óptico.

14. Un citómetro de flujo, que comprende:

a. una boquilla (42) que tiene una abertura de boquilla;

b. una corriente de fluido que sale de dicha boquilla a través de dicha abertura de boquilla;

c. un generador de gotitas al que dicha corriente de fluido responde formando gotitas, donde dichas gotitas tienen un punto de desprendimiento a una distancia de dicha abertura de boquilla;

d. un sistema de alineación óptica de citómetro de flujo de acuerdo con la reivindicación 1; donde el rayo de radiación electromagnética tiene una ruta a través de dicha corriente de fluido entre dicha abertura de boquilla y dicho punto de desprendimiento y donde el objetivo está localizado donde el rayo pasa a través de la corriente de fluido.

15. Un método para el control de dirección de un rayo de radiación electromagnética de un citómetro de flujo, que comprende las etapas de:

a. emitir un rayo de radiación electromagnética que responde direccionalmente a un elemento óptico;

b. muestrear una parte de dicho rayo de radiación electromagnética en una superficie posicionalmente sensible 55 a la incidencia de dicho rayo de radiación electromagnética;

c. generar una señal de posición del rayo de radiación electromagnética que corresponde a la posición de dicha incidencia de dicho rayo de radiación electromagnética sobre dicha superficie;

d. analizar dicha señal de posición del rayo de radiación electromagnética;

e. determinar el error de alineación de dicho rayo de radiación electromagnética con un objetivo;

f. generar una señal de corrección de la dirección del rayo de radiación electromagnética; y

g. ajustar dicho elemento óptico para corregir el error de alineación de dicho rayo electromagnético con dicha posición objetivo.

16. Un método para el control de dirección de un rayo de radiación electromagnética de un citómetro de flujo como 65 se describe en la reivindicación 15, que comprende adicionalmente la etapa de hacer correr un fluido a través de dicha posición objetivo.

17. Un método para el control de dirección de un rayo de radiación electromagnética de un citómetro de flujo como se describe en la reivindicación 15, que comprende adicionalmente la etapa de arrastrar al menos una partícula en dicho fluido, donde dicho rayo de radiación electromagnética irradia dicha partícula en dicha posición objetivo.